347
Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 347-367. Octubre-Diciembre.
ISSN 2477-9407
Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818.
Recibido el 02-05-2020 . Aceptado el 06-06-2020.
*Autor de correspondencia. Correo electrónico: vir_lopez@outlook.com
Caracterización toquímica, actividad
antioxidante y antibacteriana del aceite esencial y
extractos de Tagetes patula sobre Staphylococcus
aureus
Phytochemical characterization, antioxidant and
antibacterial activity of essential oil and extracts of
Tagetes patula on Staphylococcus aureus
Caracterização toquímica, atividade antioxidante e
antibacteriana de óleo essencial e extratos de Tagetes
patula em Staphylococcus aureus
Virginia Monserrate López Zambrano
1*
, Alex Alberto
Dueñas
Rivadeneira
2
, José Gerardo Cuenca Nevárez
2
,
Joan Manuel
Rodríguez-Díaz
3,4,5
1
Maestría de Agroindustria, Instituto de Postgrado, Universidad Técnica
de Manabí, Ecuador. Correo electrónico: vir_lopez@outlook.com,
.
2
Departamento de Procesos Agroindustriales. Facultad de Ciencias
Zootécnicas. Universidad Técnica de Manabí, Ecuador. Correo electrónico:
(AD) alduri81@hotmail.com,
;(JC) gercuenevarez12@aol.
com .
3
Laboratorio de Análisis Químicos y Biotecnológicos. Instituto
de Investigación. Universidad Técnica de Manabí, Ecuador. Correo
electrónico: joanrd9@yahoo.com, .
.
4
Departamento de Procesos
Químicos. Facultad de Ciencias Matemáticas, Físicas y Químicas.
Universidad Técnica de Manabí, Ecuador.
5
Programa de Pós-graduação
em Engenharia Química. Universidade Federal da Paraíba, 58051-900.
João Pessoa, Brasil.
Resumen
T
agetes patula es una especie vegetal ornamental y sus aceites esenciales
contienen principios activos potencialmente alelopáticos. El objetivo del presente
estudio fue evaluar la composición toquímica de extractos, la actividad
antioxidante y antibacteriana del aceite esencial de hojas con ores de la especie,
sobre Staphylococcus aureus. Para ello se realizó la extracción del aceite esencial
DOI: https://doi.org/10.47280/RevFacAgron(LUZ).v37.n4.02
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López et al. ISSN 2477-9407
por hidrodestilación, evaluándose las características físicas (solubilidad, densidad
e índice de refracción) y toquímicas de los extractos a través de un tamizaje
toquímico (alcaloides, avonoides, fenoles, saponinas, taninos y azucares
reductores). La cuanticación de fenoles en el aceite esencial se realizó mediante
el método de Folin Ciocalteu y la actividad antioxidante empleando DPPH y
ABTS, la actividad antimicrobiana mediante la determinación de la concentración
mínima inhibitoria. Los resultados obtenidos, mostraron para el aceite esencial,
una densidad de 0,733 g.mL
-1
, índice de refracción de 1,47 e insolubilidad en etanol
(70 %), presencia de taninos, avonoides y fenoles en los extractos. El contenido
fenólico fue de 1024 ± 0,19 mg.g
-1
TAE, la actividad antioxidante con DPPH, 87,6
± 0,18 µmol.g
-1
TE y con ABTS 180,83 ± 0,36 µmol.g
-1
TE
en equivalente Trolox. La
concentración mínima inhibitoria fue de 16,67 mm frente a S. aureus, ante lo cual
se concluye que, el aceite esencial de T. patula presentó actividad antioxidante
frente a los radicales DPPH y ABTS, altos contenidos fenólicos y presentó en
ensayos in vitro actividad antibacteriana frente a S. aureus.
Palabras clave: actividad antioxidante, biocontrol, Staphylococuss aureus,
Tagetes patula.
Abstract
Tagetes patula is an ornamental plant species and its essential oils contain
potentially allelopathic active ingredients. The objective of the present study
was to evaluate the phytochemical composition of extracts, the antioxidant
and antibacterial activity of the essential oil of owering leaves of the species,
on Staphylococcus aureus. For this, the extraction of the essential oil by
hydrodistillation was carried out, evaluating the physical characteristics
(solubility, density and refractive index) and phytochemical characteristics of
the extracts through a phytochemical screening (alkaloids, avonoids, phenols,
saponins, tannins and reducing sugars). The quanticatics of phenols in the
essential oil was performed by the Folin Ciocalteu method, the antioxidant activity
using the DPPH and ABTS tests, the antimicrobial activity by determining the
minimum inhibitory concentration. The results obtained showed for the essential
oil, a density of 0,733 g.mL
-1
, refractive index of 1,47 and insolubility in ethanol
(70 %), presence of tannins, avonoids and phenols in the extracts. The phenolic
content was 1.024 ± 0,19 mg.g
-1
TAE, the antioxidant activity with DPPH was
87,6 ± 0,18 µmol.g
-1
TE
and with ABTS 180,83 ± 0,36 µmol.g
-1
TE
in Trolox
equivalent. The minimum inhibitory concentration was 16,67 mm against S.
aureus, in response to which it is concluded that the essential oil of T. patula had
antioxidant activity against radicals DPPH and ABTS, high phenolic contents
and showed antibacterial activity in vitro tests against S. aureus.
Keywords: antioxidant activity, biocontrol, Staphylococcus aureus, Tagetes
patula.
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López et al. ISSN 2477-9407
Tagetes patula é uma espécie de planta ornamental e seus óleos essenciais
contêm ingredientes ativos potencialmente alelopáticos. O objetivo do
presente estudo foi avaliar a composição toquímica dos extratos, a atividade
antioxidante e antibacteriana do óleo essencial de folhas oridas das espécies,
em Staphylococcus aureus. Para isso, foi realizada a extração do óleo essencial
por hidro-destilação, avaliando as características físicas (solubilidade, densidade
e índice de refração) e as características toquímicas dos extratos por meio de
uma triagem toquímica (alcalóides, avonóides, fenóis, saponinas, taninos e
açúcares redutores). A quanticação dos fenóis no óleo essencial foi realizada pelo
método de Folin Ciocalteu e a atividade antioxidante usando DPPH e ABTS, a
atividade antimicrobiana pela determinação da concentração inibitória mínima.
Os resultados obtidos mostraram, para o óleo essencial, uma densidade de 0,733
g.mL
-1
, índice de refração de 1,47 e insolubilidade em etanol (70 %), presença
de taninos, avonóides e fenóis nos extratos. O conteúdo fenólico foi de 1024 ±
0,19 mg.g-1TAE, a atividade antioxidante com DPPH, 87,6 ± 0,18 µmol.g
-1
TE
e com ABTS 180,83 ± 0,36 µmol.g
-1
TE em equivalente Trolox. A concentração
inibitória mínima foi de 16,67 mm contra Staphylococcus aureus, em resposta
à qual se conclui que o óleo essencial de Tagetes patula apresentou atividade
antioxidante contra os radicais DPPH e ABTS, alto conteúdo fenólico e atividade
antibacteriana em testes in vitro. contra Staphylococcus aureus.
Palavras-chave: atividade antioxidante, biocontrole, Staphylococuss aureus,
Tagetes patula.
Introducción
El género Tagetes (Asteraceae)
se compone de aproximadamente
30 especies entre las cuales cerca de
la mitad están en México y en Cuba
(Paniagua et al., 2017). Tagetes patula
conocida también como cempasúchil,
or de muerto, se caracteriza por su
contenido en carotenos y avonoides
(Yim et al., 2017). La or tiene
una pigmentación amarilla que se
concentra al extraer el agua y se debe
a la presencia de pro-vitaminas A
(Shetty et al., 2015).
Los aceites esenciales (AE) están
presentes como partes del sistema de
defensa de la planta contra la infección
Introduction
The genus Tagetes (Asteraceae) is
made up of approximately 30 species,
of which about half are in Mexico and
Cuba (Paniagua et al., 2017). Tagetes
patula also known as cempasúchil,
or de muerto, is characterized by its
content in carotenes and avonoids
(Yim et al., 2017). The ower has
a yellow pigmentation that is
concentrated when water is extracted
and is due to the presence of pro-
vitamins A (Shetty et al., 2015).
Essential oils (AE) are present
as part of defense system of plant
against microbial infection. AE can
be lethal to bacteria, viruses, fungi,
Resumo
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López et al. ISSN 2477-9407
microbiana. Los AE pueden ser letales
para bacterias, virus, hongos, así como
protozoos, parásitos, ácaros e insectos,
o pueden simplemente inhibir la
producción de metabolitos, tales como
las micotoxinas (Reyes et al., 2015 y
Tajkarimi et al., 2010).
En el texto de Plant List (2013), se
destaca que los AE presentan compuestos
químicos como alcaloides, monoterpenos,
sesquiterpenos, lactonas, triterpenos,
limonoides, aminas insaturadas,
benzopiranos y terpenoides, con
importante actividad biológica contra
bacterias.
Los compuestos de naturaleza
avonoide y terpenoide son considerados
agentes antioxidantes, lo que sugiere un
uso potencial de estos toquímicos para
el tratamiento de diferentes patologías
como arterosclerosis, procesos
antiinamatorios, anticancerígenos y
para reducir los niveles de colesterol
(Gaitén et al., 2018).
El aceite esencial de T. minuta
es usado para tratar resfriados,
inamaciones respiratorias, problemas
estomacales, además tiene propiedades
como anti-espasmódico, antiparasitario,
antiséptico e insecticida (Ordoñes,
2011), en perfumería, como colorante
(fabricación de pasta, aceite vegetal,
contería, productos lácteos) y
aromatizante (Shirazi et al., 2014).
El AE tiene gran importancia
industrial y biomédica, así como
también en el campo industrial y
en la agricultura en el control de
plagas y enfermedades, debido a que
presenta compuestos bioactivos con
actividades bactericidas, fungicidas,
nematicidas e insecticidas (Politi et
al., 2012).
as well as protozoa, parasites, mites,
and insects, or they can simply inhibit
the production of metabolites, such
as mycotoxins (Reyes et al., 2015 and
Tajkarimi et al., 2010).
In the text of Plant List (2013),
it is highlighted that the AE present
chemical compounds such as alkaloids,
monoterpenes, sesquiterpenes, lactones,
triterpenes, limonoids, unsaturated
amines, benzopyrans and terpenoids,
with important biological activity
against bacteria.
Compounds of avonoid and
terpenoid nature are considered
antioxidant agents, which suggests a
potential use of these phytochemicals
for the treatment of different
pathologies such as atherosclerosis,
anti-inammatory, anticancer processes
and to reduce cholesterol levels (Gaitén
et al., 2018).
The essential oil of T. minuta
is used to treat colds, respiratory
inammations, stomach problems,
it also has properties as anti-
spasmodic, antiparasitic, antiseptic
and insecticide (Ordoñes, 2011), in
perfumery, as a dye (manufacture of
pasta, vegetable oil, confectionery,
dairy products) and avoring (Shirazi
et al., 2014).
EA has great industrial and
biomedical importance, as well as in
the industrial and agricultural elds
in the control of pests and diseases, due
to the presence of bioactive compounds
with bactericidal, fungicidal,
nematicidal and insecticidal activities
(Politi et al., 2012 ).
Munita and Arias (2017), describe
that T. patula species has components
that ensure the control of microbial
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López et al. ISSN 2477-9407
Munita y Arias (2017), describen
que la especie T. patula, tiene
componentes que aseguran el control
de la actividad microbiana, abarcando
desde avonoides, glicosilados y
tiofenos en el extracto de la planta y el
aceite esencial de la or.
Los terpenoides también están
asociados con las propiedades
antifúngicas de extractos acuosos
de Hamelia patens y la presencia de
avonoides en los aceites esenciales
ayuda a reducir la oxidación el mismo
que asegura la protección en los
alimentos (Majedy et al., 2017).
Debido a la potente acción
antibacterial de la especie vegetal T.
patula y a su naturaleza, la cantidad
de biomasa puede ser una importante
característica, que junto con el intenso
y agradable aroma hacen promisorio
el aprovechamiento de sus aceites
esenciales (Díaz, y Serrato, 2012).
La bacteria Staphylococccus
aureus se encuentra en el conducto
nasal, piel, tracto gastrointestinal y
cavidad oral; esta bacteria patógena
es causante de una gran cantidad de
infecciones cutáneas de tejidos blando,
pleuropulmonares y osteoarticulares
(Todar, 2017). Se ha demostrado que es
una bacteria resistente a antibióticos
como la meticilina (Aires, 2017),
haciéndose cada vez más necesario el uso
de nuevas alternativas para su control.
S. aureus, es una bacteria anaerobia
facultativa Gram (+), en consecuencia,
pueden transmitirse a una amplia gama
de alimentos, principalmente alimentos
derivados de animales (leche, carne
y huevos y los productos derivados) y
alimentos consumidos en crudo (frutas,
verduras, entre otros).
activity, ranging from avonoids,
glycosylated and thiophenes in the
plant extract and the essential oil of
the ower.
Terpenoids are also associated with
the antifungal properties of aqueous
extracts of Hamelia patens, and the
presence of avonoids in essential oils
helps reduce oxidation, which ensures
protection in food (Majedy et al., 2017).
Due to the powerful antibacterial
action of T. patula and its nature, the
amount of biomass can be an important
characteristic, which together with
the intense and pleasant aroma make
the use of its essential oils promising
(Díaz, & Serrato, 2012).
Staphylococcus aureus bacteria
are found in the nasal passage, skin,
gastrointestinal tract, and oral cavity;
this pathogenic bacteria is the cause
of a large number of skin infections
of the soft, pleuropulmonary, and
osteoarticular tissues (Todar, 2017). It
has been shown that it is a bacterium
resistant to antibiotics like methicillin
(Aires, 2017), making it increasingly
necessary to use new alternatives for
its control.
S. aureus, is a facultative
anaerobic Gram (+) bacterium,
consequently they can be transmitted
to a wide range of foods, mainly foods
derived from animals (milk, meat and
eggs and derived products) and foods
consumed raw (fruits, vegetables,
among others).
The objective of this work was
to evaluate the phytochemical
composition of extracts, the
antioxidant and antibacterial activity
of essential oil of the plant species T.
patula, on S. aureus.
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López et al. ISSN 2477-9407
El objetivo del presente trabajo fue
evaluar la composición toquímica de
extractos, la actividad antioxidante y
antibacteriana de aceite esencial de
la especie vegetal T. patula, sobre S.
aureus.
Materiales y métodos
Material vegetal
El material vegetal fue colectado en
la zona de Ricaurte del cantón Chone,
ubicada a una Latitud Norte -0° 34’
57,08 y Longitud Oeste -80° 2’ 25,68;
siendo este un clima cálido del litoral
ecuatoriano, del centro geográco
del cantón Chone, de la Provincia de
Manabí. Se realizó una clasicación
taxonómica depositando un espécimen
en el Herbario Nacional del Ecuador
(QCNE), con el número de registro
QCNE-007-2019 (123).
Procesamiento del material vegetal
Las hojas y ores de T. patula se
lavaron con agua potable para retirar
impurezas presentes, después de
separada del tallo. Posteriormente, se
secaron a la sombra, a temperatura
ambiente, durante tres días. Después
del secado, el material vegetal fue
molido en un molino de cuchillas
(Fritsch GmbH Pulverisette11,
México) a un tamaño de partículas
inferior a 0,5 mm y luego fue tamizado.
Extracción del aceite esencial.
La obtención del AE de hojas
con ores de T. patula se realizó
por hidrodestilación (marca
Boeco, acoplado a una trampa de
Clevenger). Para ello, se utilizó 50
g de material vegetal en 500 mL
de agua destilada, con un tiempo
aproximado de destilación de 30
Materials and methods
Vegetal material
The plant material was collected
in the Ricaurte area of the Chone
canton, located at North Latitude -0°
34’ 57,08” and West Longitude -80°
2’ 25,68”; in a warm climate of the
ecuadorian coast, of the geographical
center of the Chone canton, Province
of Manabí. A taxonomic classication
was performed by depositing a
specimen in the Herbario Nacional del
Ecuador (QCNE), with registration
number QCNE-007-2019 (123).
Plant material processing
Leaves and owers of T. patula
were washed with drinking water to
remove impurities, after separating
from stem. Subsequently, were dried
in the shade, at room temperature,
for three days. After drying, plant
material was ground in a knife mill
(Fritsch GmbH Pulverisette11,
Mexico) to a particle size of less than
0,5 mm and then sieved.
Extraction of essential oil.
Obtaining of leaves with owers
AE of T. patula was carried out
by hydrodistillation (Boeco brand,
coupled to a Clevenger trap). For
this, 50 g of plant material was used
in 500 mL of distilled water, with an
approximate distillation time of 30
minutes. Subsequently, a separation
was carried out by decantation and
immediately, oils were stored in amber
vials at 5 °C, until the respective
analysis were carried out, according to
standard NMX-K-090-1974.
Physical properties of essential oil
Refractive index: the refractive
index was determined using a
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minutos. Posteriormente, se realizó
una separación por decantación e
inmediatamente, los aceites fueron
almacenados en viales ámbar a
5 °C, hasta la realización de los
respectivos análisis, según la norma
NMX-K-090-1974.
Propiedades físicas del aceite
esencial
Índice de refracción: la
determinación del índice de refracción
se realizó utilizando un refractómetro
(ABE modelo 2WAJ, Alemania). Para
la medición, se depositaron dos gotas
de AE de T. patula sobre el prisma
del refractómetro y se procedió con la
lectura a 20 °C. Este proceso se realizó
por triplicado obteniendo su media.
Solubilidad: la solubilidad de
los AE, se determinó empleando un
tubo eppendorf de 1,5 mL, en el cual
se adicionaron 100 µL de etanol al
70 % (
v
/
v
) y 2 µL del AE; la mezcla se
homogenizó en un vórtex durante
cinco (5) min a 20 rpm. Después de
30 segundos se visualizó el eppendorf
en claridad para vericar si la mezcla
estaba homogénea, o sí se formaban
dos fases El análisis se realizó por
triplicado.
Densidad: la densidad del AE se
determinó a 20 ˚C, empleando un
picnómetro de 1 mL de capacidad,
limpio y seco. Este fue pesado en
una balanza analítica (ACZET,
modelo CY 304, Estado Unidos) y
seguidamente se adicionó 1 mL del
AE, tapándose y limpiándose el
exceso de muestra. Luego, se pesó el
conjunto y por diferencia de masa se
determinó por triplicado la densidad
relativa del AE, empleando la
ecuación 1 (Torrenegra et al., 2015).
refractometer (ABE model 2WAJ,
Germany). For the measurement, two
drops of EA of T. patula were deposited
on the prism of the refractometer and
the reading was carried out at 20
°C. This process was performed in
triplicate obtaining its mean.
Solubility: the solubility of the
AE was determined using a 1,5 mL
eppendorf tube, in which 100 µL of 70
% (
v
/
v
) ethanol and 2 µL of the EA were
added; the mixture was homogenized
in a vortex for ve (5) min at 20 rpm.
After 30 seconds the eppendorf was
visualized in clarity to verify if the
mixture was homogeneous, or if two
phases were formed. The analysis was
carried out in triplicate.
Density: the AE density was
determined at 20 ºC, using a clean
and dry 1 mL pycnometer. This was
weighed on an analytical balance
(ACZET, model CY 304, United
States) and then 1 mL of the EA was
added, covering and cleaning the
excess sample. Then, the whole was
weighed and the relative density of
the AE was determined in triplicate
by mass difference, using equation 1
(Torrenegra et al., 2015).
Equation 1
Where:
Р= AE density
Pp+M= Pycnometer mass + sample
Pp= Empty pycnometer mass
V= volume
Phytochemical screening
To evaluate the phytochemical
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Ecuación 1
Donde:
Р= Densidad del AE
Pp+M= Masa del picnómetro +
muestra
Pp= Masa del picnómetro vacío
V= volumen
Tamizaje toquímico
Para evaluar la composición
toquímica se utilizó el extracto acuso
obtenido de la extracción del material
vegetal residual de la obtención del
aceite esencial, con agua destilada,
realizando una modicación del método
de
Schabra et al. (1984).
Ensayo para alcaloides (Wagner):
Para realizar este ensayo se usó 1,0
mL del extracto acuoso al cual se le
agregó una gota de ácido clorhídrico
concentrado y tres gotas de reactivo
de Wagner, la formación de opacidad
en la muestra, indica presencia de
alcaloides.
Ensayo para avonoides (Shinoda):
para la determinación de avonoides, se
empleó 1,0 mL del extracto acuoso y se
le adicionó 1,0 mL de ácido clorhídrico y
3,0 mL de magnesio metálico, se esperó
5 minutos y después se colocó 1,0 mL
de alcohol amílico, la formación de dos
fases la primera de color amarillo y si
la segunda fase se decolora, es positivo
para avonoides.
Ensayo para fenoles (hidróxido de
sodio): para la determinación de fenoles,
se tomó 1,0 mL del extracto acuoso y
se adicionaron 6 gotas de hidróxido de
sodio al 10 %
m
/
v
, la formación de un
color amarillo, es positivo para fenoles.
composition, the aqueous extract
obtained from the extraction of the
residual plant material from obtaining
the essential oil was used, with
distilled water, making a modication
of the method of Schabra et al. (1984).
Alkaloid Assay (Wagner): To
perform this assay, 1,0 mL of the
aqueous extract was used to which
was added one drop of concentrated
hydrochloric acid and three drops
of Wagner’s reagent, formation of
opacity in the sample, indicates
presence of alkaloids.
Test for avonoids (Shinoda):
for the determination of avonoids,
1.0 mL of the aqueous extract was
used and 1.0 mL of hydrochloric
acid and 3.0 mL of metallic
magnesium were added, it was left
to stand for 5 minutes and then
1.0 mL of amyl alcohol was placed,
the formation of two phases, the
rst one yellow, and if the second
phase discolors, it is positive for
avonoids.
Test for phenols (sodium
hydroxide): for the determination
of phenols, 1.0 mL of the aqueous
extract was taken and 6 drops of
10 %
m
/
v
sodium hydroxide were
added, forming a yellow color, is
positive for phenols.
Test for saponins: to determine
the presence of saponins, 2.0 mL
of the aqueous extract was placed
in a test tube and stirred for 10
minutes, foaming for 2 minutes,
indicates the presence of saponins.
Test for phenols and / or tannins
(ferric chloride): in this test, 1.0 mL
of the aqueous extract was used
to which 3 drops of 5 %
m
/
v
ferric
355
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López et al. ISSN 2477-9407
Ensayo para saponinas: para
la determinación de la presencia
de saponinas se colocó 2,0 mL del
extracto acuoso en un tubo de ensayos
y se agitó por 10 minutos, la formación
de espuma por 2 minutos, indica
presencia de saponinas.
Ensayo para fenoles y/o taninos
(cloruro férrico): en este ensayo, se usó
1,0 mL del extracto acuoso al cual se
adicionaron 3 gotas de cloruro férrico
al 5 %
m
/
v
, la formación de un color
verde oscuro, es positivo para fenoles
y/o taninos.
Ensayo para azucares reductores
(Benedict): en la determinación
de azúcares, se empleó 0,5 mL del
extracto acuoso, luego se adicionó el
reactivo de Benedict, hasta que tomó
un color azul. Posteriormente, se
colocó en un baño de maría hasta que
alcanzara una temperatura de 60 °C
por 10 minutos, un cambio de color
a marrón es positivo para azúcares
reductores.
Actividad antioxidante del aceite
esencial de Tagetes patula
Contenido fenólico: El contenido
fenólico total (TPC) se determinó
según el método descrito por Moreno
et
al. (2015), utilizando ácido tánico como
estándar, y para la cuanticación, se
empleó una ecuación de regresión (y=
9,269529E.04 X, R
2
= 0,997), basada
en una curva de calibración estándar
a diferentes concentraciones (50, 100,
150, 200, 250, 500, 750,1000 mg.L
-1
de ácido tánico). Para el análisis, se
preparó una mezcla de 3,41 µL de
aceite esencial en 21,59 mL de agua
destilada, de esta mezcla se tomaron
200 µL y se adicionaron 1,5 mL de
agua destilada y 100 µL del reactivo
chloride were added, the formation
of a dark green color, it is positive
for phenols and/or tannins.
Test for reducing sugars (Benedict):
in the determination of sugars, 0.5
mL of the aqueous extract was used,
then the Benedict reagent was added,
until it turned blue. Subsequently, it
was placed in a water bath until it
will reach a temperature of 60 °C for
10 minutes, a color change to brown is
positive for reducing sugars.
Antioxidant activity of the essential
oil of Tagetes patula
Phenolic content: The total phenolic
content (TPC) was determined
according to the method described
by Moreno et al. (2015), using tannic
acid as the standard, and for the
quantication, a regression equation
(y = 9,269529E.04 X, R
2
= 0.997) was
used, based on a standard calibration
curve at different concentrations (50,
100, 150, 200, 250, 500, 750.1000
mg.L
-1
of tannic acid). For the analysis,
a mixture of 3.41 µL of essential oil
in 21.59 mL of distilled water was
prepared, 200 µL were taken from this
mixture and 1.5 mL of distilled water
and 100 µL of the Folin-Ciocalteu
reagent were added. It was left to rest
during 5 minutes, then 200 µL of 20
%
m
/
v
sodium carbonate were added.
The solution was left to stand during 1
hour at room temperature without the
presence of light and absorbance was
read in a spectrophotometer (Genesys
180UV/VIS brand, United States), at
a wavelength of 730 nm. The results
were expressed in mg.g
-1
tannic acid
equivalents (TAE).
DPPH method: The antioxidant
activity using the DPPH method
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López et al. ISSN 2477-9407
Folin-Ciocalteu, se dejó reposar por
cinco (5) minutos, luego se le agregaron
200 µL de carbonato de sodio al 20%
m
/
v
. La solución se dejó reposar por
una (1) hora a temperatura ambiente
sin presencia de luz y se procedió
a la lectura de absorbancia en un
espectrofotómetro (marca Genesys
180UV/VIS, Estados Unidos), a una
longitud de onda de 730 nm. Los
resultados se expresaron en mg.g
-1
equivalentes
de
ácido tánico (TAE).
Método de DPPH: La actividad
antioxidante empleando el método
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo),
se determinó de acuerdo con el método
propuesto por Kondo et al. (2002).
Inicialmente se preparó el radical
DPPH, para lo cual se pesaron 3,9432
mg del reactivo DPPH y se disolvió en
100 mL de metanol. Para el análisis
de las muestras, se mezclaron 1,0 mL
del aceite esencial diluido y 1,0 mL de
reactivo DPPH, se dejó reposar por
30 minutos a temperatura ambiente
en la oscuridad. La absorbancia
se midió en el espectrofotómetro
(marca Genesys 180UV/VIS, Estados
Unidos), a una longitud de onda de
517 nm. La cuanticación se realizó
a partir de una curva de calibración
con trolox (2,5, 5, 10, 15, 20, 30 μM de
trolox). Los resultados se expresaron
en equivalentes Trolox (TEAC).
Método de ABTS: La actividad
antioxidante empleando el método
ABTS (ácido 2,2- azinobis-3-etil
benzotiazolina-6-sulfónico), se
determinó de acuerdo a la metodología
utilizada por Runo et al. (2007).
Inicialmente, se preparó el radical
ABTS
+
, para lo cual se pesaron
90,0585 mg de ABTS y se disolvieron
(2,2-dipheny-l-1-picrilhydrazyl), was
determined according to the method
proposed by Kondo et al. (2002).
Initially, the DPPH radical was
prepared, for which 3.9432 mg of the
DPPH reagent were weighed and
dissolved in 100 mL of methanol. For
sample analysis, 1.0 mL of the diluted
essential oil and 1.0 mL of DPPH
reagent were mixed, allowed to stand
for 30 minutes at room temperature
in the dark. Absorbance was
measured on the spectrophotometer
(Genesys 180UV/VIS brand, United
States), at a wavelength of 517 nm.
Quantication was performed from
a trolox calibration curve (2.5, 5, 10,
15, 20, 30 µM trolox). The results
were expressed in Trolox equivalents
(TEAC).
ABTS method: The antioxidant
activity using the ABTS method
(2,2-azinobis-3-ethyl benzothiazoline-
6-sulfonic acid), was determined
according to the methodology used
by Runo et al. (2007). Initially, the
ABTS
+
radical was prepared, for which
90.0585 mg of ABTS were weighed
and dissolved in 25.0 mL of distilled
water to obtain a concentration of 7.0
mM. Subsequently, 16.5573 mg of
potassium persulfate were weighed
and dissolved in 25.0 mL of distilled
water to obtain a concentration of
2.45 mM, immediately afterwards,
the solutions of ABTS and potassium
persulfate were mixed and allowed to
react for 12 h at room temperature,
in the dark. For the analysis of
the samples, 1.0 mL of the diluted
essential oil mixture was used and
1.0 mL of ABTS
+
reagent was added,
leaving it to stand for one hour in
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en 25,0 mL de agua destilada para
obtener una concentración de 7,0 mM.
Posteriormente, se pesaron 16,5573 mg
de persulfato de potasio y se disolvieron
en 25,0 mL de agua destilada para
obtener una concentración de 2,45
mM, inmediatamente después, se
mezclaron las soluciones de ABTS
y persulfato de potasio y se dejaron
reaccionar por 12 h a temperatura
ambiente, en la oscuridad. Para el
análisis de las muestras, se usó 1,0 mL
de la mezcla diluida del aceite esencial
y se adicionó 1,0 mL de reactivo ABTS
+
,
dejándolo en reposo durante una
hora en la oscuridad y a temperatura
ambiente. La absorbancia se midió en
el espectrofotómetro (Genesys 180UV/
VIS, Estados Unidos), a una longitud
de onda de 734 nm. La cuanticación
se realizó a partir de una curva de
calibración con trolox (1,25, 2,5, 5, 10,
15, 20 μM de trolox). Los resultados
se expresaron en equivalentes trolox
(TEAC).
Actividad antibacteriana.
Para los ensayos microbiológicos, se
trabajó con la bacteria Staphylococcus
aureus donada por el Cepario
del Laboratorio de Microbiología
DISerLAB PUCE. Inicialmente, se
realizó la siembra, en agar sangre,
incubándose por 24 horas a 37 °C.
La cepa aislada, se inoculó en agar
nutritivo, mediante una siembra
en estría, con dos repeticiones, y se
incubó por 24 horas a 37 °C. Luego
se conservó en refrigeración a 4 °C.
A partir del cultivo bacteriano en el
agar nutritivo se seleccionaron cuatro
colonias de cada una y se diluyeron en
solución salina, hasta alcanzar una
turbidez igual a la del tubo 0,5 de la
the dark and at room temperature.
Absorbance was measured on the
spectrophotometer (Genesys 180UV/
VIS, United States), at a wavelength
of 734 nm. Quantication was
performed from a trolox calibration
curve (1.25, 2.5, 5, 10, 15, 20 μM of
trolox). The results were expressed in
trolox equivalents (TEAC).
Antibacterial activity.
For the microbiological tests,
the bacterium Staphylococcus
aureus donated by the Cepario of
the Laboratorio de Microbiología
DISerLAB - PUCE was used. Initially,
sowing was performed on blood agar,
incubating for 24 hours at 37 °C.
The isolated strain was inoculated
on nutrient agar, by streak seeding,
with two replications, and incubated
during 24 hours at 37 °C. It was then
kept refrigerated at 4 °C. From the
bacterial culture on nutrient agar,
four colonies of each were selected
and diluted in saline solution, until
reaching a turbidity equal to that
of tube 0.5 of the MacFarland scale
(Montero et al., 2018). Then, a massive
seeding was performed on Mueller
Hinton agar.
The antibacterial activity of T.
patula oil was determined by the
disc diffusion method proposed by
Kumar and Hazeena (2002). For this,
the diluted strain was massively
seeded on the agar and ve 6 mm
diameter Whatman lter paper
discs, impregnated with 0.2 mL of
essential oil and distilled water,
were placed on the surface of the
medium as a negative control and
incubated at 37 °C for 24 hours. The
test was carried out in triplicate.
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López et al. ISSN 2477-9407
escala de MacFarland (Montero et al.,
2018). Luego, se efectuó una siembra
masiva sobre agar Mueller Hinton.
La actividad antibacteriana del
aceite de T. patula se determinó
por el método de difusión en disco
propuesto por Kumar y Hazeena,
(2002). Para lo cual la cepa diluida
se sembró masivamente sobre el agar
y se colocaron en la supercie del
medio, cinco discos de papel de ltro
tipo Whatman de 6 mm de diámetro,
impregnados con 0,2 mL del aceite
esencial y agua destilada, como control
negativo y se incubaron a 37 °C, por
24 horas. El ensayo se efectuó por
triplicado. Posteriormente, se midió
el diámetro del halo de inhibición del
crecimiento del microorganismo.
La concentración mínima
inhibitoria (CMI), se aplicó para
determinar la menor concentración del
extracto que inhibe el crecimiento de
S. aureus. Según Gómez, et al. (2007),
para realizar este análisis, en primer
lugar, se prepararon soluciones de los
aceites en agua destilada (0,5 µg.mL
-1
,
0,8 µg.mL
-1
y 1 µg.mL
-1
). De cada uno de
estos, se tomó 1,0 mL, para la dilución
en el medio de cultivo (Martínez, et al.,
2000). La CMI, se evaluó por triplicado.
Análisis estadístico
Para realizar el análisis estadístico
de los datos, se aplicó un ANOVA
unifactorial que permitió comparar
tres concentraciones de aceite esencial
(0,5, 0,8, 1,0 µg.mL
-1
) sobre la variable
cuantitativa, que es la actividad
antibacteriana del mismo. En lo que
respecta a la igualdad de varianzas,
se aplicó la prueba de Levene. La
signicancia, se calculó con un nivel
de conanza del 95 % (p=0,05). Para
Subsequently, the diameter of the
microorganism growth inhibition
halo was measured.
The minimum inhibitory
concentration (CMI) was applied to
determine the lowest concentration
of the extract that inhibits the
growth of S. aureus. According to
Gómez, et al. (2007), to carry out this
analysis, rstly, solutions of the oils
were prepared in distilled water (0.5
µg.mL
-1
, 0.8 µg.mL
-1
and 1.0 µg.mL
-1
).
From each of these, 1.0 mL was taken,
for dilution in the culture medium
(Martínez, et al., 2000). The CMI was
evaluated in triplicate.
Statistical analysis
To perform the statistical data
analysis, a unifactorial ANOVA was
applied that allowed comparing three
concentrations of essential oil (0. 5,
0.8, 1.0 µg.mL
-1
) on the quantitative
variable, which is its antibacterial
activity. Regarding equality of
variances, the Levene test was applied.
Signicance was calculated with a
condence level of 9