REDIELUZ
ISSN 2244-7334 / Depósito legal pp201102ZU3769 Vol. 12 N° 1 • Enero - Junio 2022 : 82 - 96
ENTEROCYTOZOON BIENEUSI Y ENCEPHALYTOZOON INTESTINALIS EN PACIENTES VIH POSITIVOS CON SÍNDROME DIARRÉICO. REVISIÓN
Enterocytozoon bieneusi and Encephalytozoon intestinalis in HIV positive patients with diarrheal syndrome. Review
1Universidad Estatal de Milagro (UNEMI), 2Laboratorio Clínico y Microbiológico “PAZMIÑO” https://orcid.org/0000-0002-2611-2428
El Phylum Microsporidia es considerado un pa- tógeno oportunista, capaz de producir desde una infección localizada hasta una infección sistémica. Enterocytozoon bieneusi fue la primera especie identificada en Haití en el año 1985 en pacientes VIH - SIDA con diarrea acuosa excesiva, desde en- tonces, es el más común de los Microsporidios que se presenta en los seres humanos. Posteriormente se identifica a Septata intestinalis, actualmente cla- sificado en el género Encephalytozoon intestinalis, siendo la segunda especie causante de diarreas diseminadas. Por otro lado, es necesario comentar que los métodos rápidos y sencillos por microsco- pia óptica, no son suficiente para dar el diagnóstico diferencial de los dos géneros, por lo tanto, es in- dispensable usar métodos como anticuerpos mo- noclonales por Inmunofluorescencia, biología mo- lecular a través de la técnica reacción en cadena de la Polimerasa (PCR), y microscopía electrónica de transmisión, cabe mencionar que los laborato- rios de rutina no los pueden realizar por los altos costos de las pruebas y equipamiento. El objetivo de este trabajo fue realizar una revisión bibliográfi- ca de la prevalencia de Enterocytozoon bieneusi y Encephalytozoon intestinalis, epidemiología, diag- nóstico, tratamiento y prevención.
Phylum Microsporidia is considered an oppor- tunistic pathogen capable of producing from a lo- calized infection to a systemic infection. Enterocy- tozoon bieneusi was the first species identified in Haiti in 1985 in HIV-AIDS patients with excessive watery diarrhea, since then it is the most common Microsporidia occurring in humans. Later, Septata intestinalis was identified and is currently classified in the genus Encephalytozoon intestinalis, being the second species causing disseminated diarrhea. On the other hand, it is necessary to comment that fast and simple methods by optical microscopy are not enough to give the differential diagnosis of the two genera, therefore, it is essential to use methods such as monoclonal antibodies by Immunofluores- cence, molecular biology through the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique, and transmission electron microscopy, it is worth mentioning that rou- tine laboratories cannot perform them due to the high costs of tests and equipment. The objective of this work was to carry out a bibliographic review of the prevalence of Enterocytozoon bieneusi and Encephalytozoon intestinalis, epidemiology, diag- nosis, treatment and prevention.
nales, inmunofluorescencia, biología molecular,
microscopía electrónica de transmisión, epidemio- logía.
Los Microsporidios son parásitos obligados no poseen mitocondrias, centriolos, aparto de Golgi y cuenta con un RNA de tipo procariota al inicio se lo ubicó en el grupo de los protozoos, pero a través del tiempo con estudios genéticos, estructurales y metabólicos se reclasificaron en el reino Fungi, Filo: Zygomyceta, Clase: Microsporidia, Subclase: Diha- plophasea y Haplophasea.
Hasta el momento se han descrito más de 1.700 especies que afectan a animales vertebrados e invertebrados, además ciertas especies atacan a las personas inmunodeprimidas, receptores de ór- ganos y pacientes que han recibido quimioterapia inmunosupresora. (Neil A, Camphell J., 2017) (Han et al., 2021)
El CDC de Atlanta describe alrededor de 15 especies de Microsporidios patógenos para el ser humano: Ancalia algarae, Ancalia connori, An- calia vesicularum, Encephalytozoon intestinalis, Encephalytozoon hellem, Encephalytozoon cu- niculi, Enterocytozoon bieneusi, Microsporidium ceylonensis, Microsporidium africanum, Nosema ocularum, Pleistophora ronneafiei, Trachipleisto- phora hominis,Trachipleistophora anthropophthera, Vittaforma corneae y Tubuli nosema acridophagus y endoreticulatus. (CDC, 2019)
El primer caso de microsporidium se identificó en 1959 por Matsubyashi y colaboradores, quienes aislaron en muestra de líquido cefalorraquídeo en un niño de 9 años con encefalitis. (Fernández et al., 2002)
Los géneros Enterocytozoon bieneusi y En- cephalytozoon intestinalis afectan al tracto gastroin- testinal actúan como microorganismos oportunistas con énfasis en pacientes con VIH-SIDA y trasplan- tados, siendo importante la diferencia de género para fines terapéuticos, es necesario señalar que la diseminación extra intestinal puede lesionar otros órganos como , riñones, corazón, tracto respira- torio, hígado y cerebro, se trasmiten por vía oral causando calambres abdominales, diarrea, malab- sorción y pérdida de peso diarrea, malabsorción y pérdida de peso en pacientes con sida. (Ghoshal et al., 2016) (Han & Weiss, 2017)
Cabe mencionar que Enterocytozoon bieneusi es el género más común e infecta al 90% de hu- manos y Encephalytozoon intestinalis al 10%, alte- rando y disminuyendo la capacidad inmunológica y son presa fácil de cualquier infección oportunista,
así como infecciones diarreicas agudas y cróni- cas siendo el blanco perfecto de microorganismos oportunistas que pueden llevarlos a la muerte, otro parámetro importante del laboratorio clínico es el recuento de linfocitos CD4+ que se encuentran en un nivel inferior a 100 células/mm3. (Noda et al., 2013)
Enterocytozoon bieneusi fue la primera especie identificada en Haití en el año 1985 en pacientes VIH - SIDA con diarrea acuosa excesiva, es un pa- tógeno emergente en el trasplante de órganos sóli- dos, principalmente en los receptores de trasplante renal. (Bedoya et al., 2008) (Moniot et al., 2021) y posteriormente se observó en muestras de cerdo, animales, salvajes, domésticos y de granja, así como en aguas superficiales, se han detectado en 236 especies de animales,
Se considera que la transmisión zoonótica es la principal fuente de infección y puede ocurrir por contacto directo con animales, con saneamiento inadecuado, o indirectamente por la ingestión de agua o alimentos contaminados con estos micror- ganismos. (Kwon et al., 2021)
Encephalitozoon intestinalis conocido como Septata intestinalis se aisló en paciente colombiano con diarrea crónica en cultivo celular (mono capas de células). (Bedoya et al., 2008) (Da Silva et al., 1997) (T. Van Gool et al., 1994)
Este hongo infecta y se desarrolla dentro de los macrófagos intestinales, propagándose la infección desde el intestino a otros órganos, posiblemente responsable de infecciones oculares y hepáticas. (de Moura et al., 2019) (E. S. Didier & Weiss, 2006) La vía de trasmisión es fecal-oral, oral-oral, inhala- ción de aerosoles, agua y alimentos contaminados, contacto directo con piel u ojos lesionados y trans- misión sexual. (Halánová et al., 2019)
Se han notificado casos de Microsporidios a ni- vel mundial que fluctúan entre el 3.5% al 50% de casos, en Alemania, Argentina, Australia, Botswa- na, Brasil, Canadá, España, los Estados Unidos de América, Francia, India, Italia, Japón, Nueva Zelandia, los Países Bajos, el Reino Unido, la Re- pública Checa, Sri Lanka, Suecia, Suiza, Tailandia, Uganda, Zambia, Venezuela, Colombia, Ecuador. (Chacin-Bonilla et al., 2006) (Pazmiño et al., 2014) (Bedoya et al., 2008) (OPS/OMS, 2003)
El diagnóstico de laboratorio para Microsporidios requiere perseverancia, porque las esporas son tan pequeñas que resulta difícil su identificación. En la actualidad se procesan muestras de tejidos, heces,
fluidos corporales, escarificada corneal y posterior- mente por microscopía se observan las esporas.
Existen diferentes métodos para identificar Mi- crosporidios como Tinción de Gram Chromotropo rápido, Tricrómica modificada de Weber y Tricrómi- ca de Rayan de alta sensibilidad y especificidad, el método de inmunofluorescencia, Microscopía de Barrido, Microscopía de transmisión, Western Blot y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Considerado por el Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) como los métodos de re- ferencia para la identificación de Microsporidios. (Acha & Szyfres, 2001a) (Winn et al., 2008)
Es el más significativo de todos, produce pato- logías en el hombre se identificó por primera vez por Desportes en 1985 en pacientes con VHI.SIDA. Las esporas de este microorganismo son capaces de infectar a diferentes hospedadores desde pro- tistas a mamíferos incluido el hombre, se ubica en los enterocitos del intestino delgado, causando un síndrome diarreico crónico o enfermedad biliar en pacientes inmunodeficientes se ha encontrado en el epitelio nasal, bronquial, y traqueal.
La espora es de forma ovalada con capacidad infectante y puede permanecer por largo tiempo en el medio ambiente ingresa al huésped e inyecta en el citoplasma su esporoplasma adhiriéndose a los tejidos, su tamaño es de 2 a 4 micras, tiene una exospora proteínica electro densa y una endospora quitinosa y electro lúcido confiriéndole resistencia a los factores ambientales, tiene además un es- poroplasto uni o binuclear, el cual, es inyectado a la célula huésped a través del filamento polar que posee de 5 a 7 espiras, dispuestas en doble hile- ra y se lo identifica dentro de los enterocitos de la pared del intestino del hombre. (Romero Cabello, 2018),(Moncada & Pérez, 1998) (Fresnadillo et al., 2010)(Han et al., 2020)
Es la segunda especie que, ocasiona diarrea afectando principalmente a pacientes inmunode- primidos con VIH-SIDA, además, puede ocasionar una enteritis severa, presenta mala absorción e infecciones generalizadas. Denominado anterior- mente como Septata intestinalis y reclasificado como Encephalytozoon intestinalis en base a los estudios genéticos e inmunológicos, sus células se caracterizan por tener de uno a cuatro núcleos, se
desarrollan en el enterocito dentro de una vacuola parasitófora, separado por dos septos en estado esporogónica, las esporas miden de 1.2 a 2 micras y el filamento polar presenta de 4 a 7 vueltas.
Este género infecta las células epiteliales, endo- teliales, células presentadoras de antígenos como las células dendríticas y de Langerhans, macrófa- gos del intestino. Fibroblastos, en el hígado infecta las células de Kupffer, y se disemina a los riñones ocasionado una nefritis túbulo intersticial que se presenta con dolor de espalda, disuria y hematuria, puede diseminarse al epitelio del tracto respiratorio causante de infecciones oculares, hepáticas quera- titis, meningoencefalitis y miositis. (Romero Cabe- llo, 2018) (Murray et al., 2021)
Tiene un amplio reservorio tanto en vertebrados como invertebrados y se encuentra distribuida en todo el mundo, existen diferentes animales domés- ticos y salvajes que pueden infectarse con Micros- poridios de importancia médica. Enterocytozoon bieneusi generalmente se considera un parásito humano, pero se ha identificado en cerdos, prima- tes, ganado, gatos, perros, tejón europeo, garduña y zorro rojo, pollos y palomas, peces y otros mamí- feros, se transmite a humanos por contacto directo fecal-oral, oral-oral, inhalación e ingestión de espo- ras. (Murray et al., 2021)(lvarado G. et al., 2009)
Algunas, de estas cepas derivadas de animales se pueden presentar como genotipos zoonóticos.
E. intestinalis casi nunca se identifica en animales
diferentes al ser humanos.
No se ha informado en la actualidad de otras especies de Microsporidios infecten al hombre no se ha identificado ningún reservorio animal para el género Vittaforma corneae. Pleistophora spp. se encuentran en peces y reptiles, pero la forma de las esporas en estas especies es similar con la de las especies que ocasionan infecciones humanas (P. ronneafiei). Tubuli nosema acridophagus, Trachi- pleistophora spp. Y Anncaliia algerae están ligados con parásitos de insectos conocidos, sin embargo, la importancia de los insectos en la transmisión no es está despejada para la ciencia e investigación. (CDC, 2019)(Velásquez et al., 1996)(Santín et al.,
2018)(Vergneau-Grosset & Larrat, 2015)
El hombre se ha infectado por Microsporidios a través de un traumatismo o por contacto directo. Existen estudios que evidencian que se ha tomado como patrón de estudio los animales de laboratorio inoculándoles Microsporidios a nivel intraperitoneal, intravenosa, intrarectal, intratraqueal e intracere- bral (Gómez Puerta, 2013) (Shadduck & Orenstein, 1993; Snowden et al., 1998; Weber et al., 1994)
Se multiplican por merogonia (división binaria) y por esporogonia (producción de esporas), presen- tando tres fases: fase de infección, fase de mero- gonia y fase de esporogonia. (Madrid et al., 2012) (Moncada & Pérez, 1998)
Después del contacto de la espora con la mem- brana celular inicia el proceso de endocitosis de la espora y el ingreso del esporoplasma del fago liso- soma maduro a través del túbulo polar, se presenta la infección secundaria en la vacuola parasitófora, así como en Encephalytozoon spp., que puede re- plicarse dentro de los macrófagos o desde el cito- plasma de una célula a otra cercana y a través del túbulo polar extruido se produce la fagocitosis. (C. Franzen, 2008)
Las infecciones primarias por E. bieneusi se dan en las células endoteliales del intestino delgado y de la vesicular biliar, las esporas maduras son libe- radas al lumen intestinal y eliminadas en las heces de los hospederos. (D. Kotler & Orenstein, 1999; D.
P. Kotler & Orenstein, 1998) Las esporas maduras de E. bieneusi poseen un solo núcleo, contienen un filamento polar que se enrolla aproximadamente seis veces en una alineación de dos hileras, y son los más pequeños de los Microsporidios, midien- do aproximadamente 1,0 x 1,5 micras (Figura. 1) (Desportes et al., 1985)(Neil A., Camphell J., 2017) (Contreras, 2006)
Figura 1. Diferentes mecanismos de invasión de la célula hospedadora por esporas de Microsporidios
Fuente: Tomado y modificado de Franzen (2008)
Fase de Merogonia: Llamada esquizogonia es la fase vegetativa , una vez que ingresa a la célu- la, el esporoplasma que es expulsado por el túbulo polar inicia la fase de merogonia transformándose en merontes, tienen forma redonda, elongadas e irregulares con escaso retículo endoplásmico no rugoso rudimentario, el citoplasma está rodeado
por una membrana plasmática con escaso retículo endoplásmico, los merontes son simples o dobles, pueden originar células multinucleadas, redondas refráctiles y plasmodiales.
En esta fase de merogonia se reproducen dentro de las vesículas parasitófora desprendiendo nue-
vas esporas y a través de su filamento polar lle- gan a otras células, a las que inyectan su material endoplásmico para infectarlas. E. intestinalis., en lo seres humanos luego de la fase de merogonia en las células susceptibles se pueden diseminar por vía sanguínea o linfática (Botero-Garcés & Monto- ya-Palacio, 2002) (Romero Cabello, 2018)
Fase de Esporogonia: El proceso de la madu- ración de las esporas e inicia la esporogonia en el momento en que los merontes se rodean de una capa superficial amorfa y se forman los esporontes. Estos crecen y se multiplican por división binaria o múltiple hasta transformarse en los esporoblastos que son los precursores de las esporas maduras resistentes a las condiciones del medio ambiente. Estas estructuras al ser ingeridas, se adosan al tejido por medio del filamento polar implantando los ácidos nucleicos y el material citoplasmático al nuevo hospedero (Fernández et al., 2002) (Neil A., Camphell J., 2017). (Contreras, 2006) (Vesga et al., 2015)(Chinchilla et al., 1998)
Encephalytozoon intestinalis
La Microsporidiosis humana es universal con un rango de prevalencia que oscilan entre 3.5% al 50% dependiendo de la región geográfica, es frecuente en individuos infectados por VIH - SIDA. En estu- dios realizados en Estados Unidos de Norte Améri- ca, Australia, Países Bajos e Inglaterra se ha iden- tificado Enterocytozoon bieneusi del 15 al 30% en pacientes con VHI, En Venezuela Enterocytozoon bieneusi se identificó el 14% en niños desnutridos y el 8% en niños eutróficos. (Acurero et al., 2015) (Vàsquez et al., 1997)
En Argentina la infección por E. intestinalis que afecta al hombre es el 10%. en pacientes con SIDA y E. bieneusi oscila del 7 al 50%. (Ministerio_de_ Salud_Argentina, 2001)
En los países en vía de desarrollo E, bieneusi presenta una tasa de prevalencia que oscila entre el 2.5 y 51%, el 0,8% en niños africanos VIH sero- negativos. En Colombia, el 3% corresponde a En- terocytozoon bieneusi y 1% a Encephalytozoon in- testinalis. En África la prevalencia de E. intestinalis y Encephalytozoon intestinalis varía entre 7 y 51%. Las tasas de infección por Enterocytozoon bieneusi en Tailandia fueron 2,15%.
Los estudios de Seroprevalencia en Suecia, in- dicaban rangos de 0 a 42% con altas tasas en ho- mosexuales y personas con otra etología parasita-
rias. En un estudio en Francia, encontraron títulos de anticuerpos contra especies de Encephalitozoon en 5% en mujeres embarazadas y en Holanda 8% de donantes de sangre. (Tom Van Gool et al., 1997) (Ojuromi et al., 2012)(Matos et al., 2012)(Matos et al., 2012)
La respuesta inmune contra E. bieneusi es es- caso por cuanto existe ausencia de modelos ani- males apropiados y a lo complejo que es cultivarlo en tejido.
Los Microsporidios cuando tienen una respuesta inmune equilibrada pueden subsistir en estado de latencia en el interior del enterocito por largos perio- dos de tiempo, sin presentar manifestación clínica. En cambio, los pacientes con VHI-SIDA son más susceptibles a infecciones oportunistas secunda- rias como consecuencia de la disminución de los linfocitos TCD4+ menor a 100/mm3 en sangre y se puede aumentar con el uso de antirretroviral de alta eficacia (TARVAE) (Noda Albelo et al., 2013) es im- portante mantener fortalecida la respuesta inmune celular para protegerlo de los diferentes patógenos que invaden el sistema inmunológico.(Marchant, 2006) (Noda Albelo et al., 2013) la infección se ac- tiva con la producción de anticuerpos que aparen- temente no tienen un efecto protector. (Moncada & Pérez, 1998)
Los anticuerpos reconocen la pared de la espora y el tubo polar (Noda Albelo et al., 2013), se eviden- cia la función de la inmunidad mediada por células en la resistencia contra la infección por Microspo- ridios al presentar formas graves de la enferme- dad en pacientes VHI.SIDA y trasplantados, cabe mencionar que las especies de Encephalitozoon spp son capaces de evadir la respuesta inmune del hospedero sobreviviendo en el interior del ma- crófago (Moncada & Pérez, 1998)(Marchant, 2006) (Noda Albelo et al., 2013)
Se han realizado estudios experimentales en modelos murinos y estudios ex vivo activándo- se las citocinas pro inflamatorias como Interferón gamma-γ (IFN-γ), interleukina-12 (IL-12), y tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) que actúan lu- chan en la resistencia contra Encephalitozoon spp. (C. Franzen, 2008; Noda Albelo et al., 2013; Salát & Braunfuchsová, 2002)
En Suecia se realizó un estudio de cohorte sobre
bieneusi y se lo asoció con un brote alimentario, se presume que el proceso de incubación se llevó a cabo en 9 días hasta el inicio de la sintomatología. (Decraene et al., 2012)
Las manifestaciones clínicas, se presentan con diarrea es el principal síntoma , dolor abdominal, fiebre, pérdida de peso, deshidratación y gases (flatulencia), la patogénesis a nivel intestinal está relacionada con la muerte de los enterocitos por efecto de la infección celular, clínicamente se pre- senta diarrea y pérdida de peso como consecuen- cia del daño, que se produce en el intestino delga- do, mostrando atrofia parcial de las vellosidades e hiperplasia de las criptas y malabsorción (D. Kotler & Orenstein, 1999) Cabe resaltar que, estos tras- tornos dependen del estado inmunológico, edad, personas inmunodeprimidas, inmunocompetentes, pacientes geriátricos, trasplantados, cáncer y VIH seropositivos (Lores et al., 2002; Weiss & Becnel, 2014), en el caso de personas inmunocompeten- tes, la diarrea es auto limitada debido a la función de protección del sistema inmune. (Weiss & Bec- nel, 2014) No obstante, E. bieneusi, puede disemi- narse a otros órganos como el tracto, respiratorio produciendo tos, disnea asma y colangitis biliar. (Velásquez et al., 2012)
En países desarrollados la infección por este mi- croorganismo está disminuyendo debido al uso de la terapia antirretroviral en inmunodeprimidos, en cambio en pacientes trasplantados, el número de casos se ha incrementado, presentándose la pato- logía días o años después del trasplante. (Galván et al., 2011)
La transmisión de la infección por Microsporidios ocurre tiene diversas formas de trasmitirse a través de los alimentos en también se incluye la industria de la cadena alimentaria mundial de peces y crus- táceos como camarones, langostas, almejas, a tra- vés del agua potable, incluido el agua del riego de cultivos, agua de mar, aguas subterráneas, aguas residuales, las excretas en el medio ambiente y es- pacios con lodos. (Stentiford et al., 2016)
La transmisión vertical de madre a hijo, pero de animales como conejos, ovejas se ha observado en conejos, ovejas. Algunos estudios manifiestan que, existe una la transmisión zoonótica a través de ani-
males que actúan como reservorios. (Fiuza et al., 2016; Stentiford et al., 2016) Aunque es inusual, la transmisión fecal-oral y aerosoles, también, puede ocurrir en casos de infección en los seres humanos. (P. J. Didier et al., 2006)
El tratamiento para E. bieneusi. Es albendazol 400 mg por vía oral 2 veces por 21 a 28 días al día en adultos, en niños 15mg/kg/ 2 veces al día durante 7 días 2 a 4 semanas, de acuerdo al cua- dro clínico más el tratamiento antirretroviral eficaz. (OPS/OMS, 2022)(Pearson, 2020)
Algunos refieren que hay respuesta al albenda- zol, metronidazol, pero al realizar estudios histoló- gicos, se evidencia que la infección persiste, (Con- treras, 2006)(Murray et al., 2021) también, utilizan albendazol, furazolidone, thalidomide, azitrhromy- cin o atovaquone, que son eficaces dependiendo del estado del paciente y el compromiso inmuno- lógico, Las alternativas terapéuticas, actualmente tienen mejor perspectiva puesto que existen otro tipo de hospederos diferentes al humano así como macacos y cerdos que pueden utilizarse como es- tudio piloto en busca de nuevas terapéuticas para el tratamiento de E. bieneusi.
Además, el uso de la terapia de antiretroviral puede intervenir en la supresión del virus de inmu- nodeficiencia humana y disminuir la eliminación de esporas de E. bieneusi, cabe indicar que, todavía no existe tratamiento para este microorganismo, se ha improvisado en muchos casos la acción te- rapéutica pero existe el riesgo de producir mala ab- sorción decreciendo el nivel de los medicamentos anti-VIH que llegan a la sangre. Es necesario tener en cuenta en el tratamiento de la Microsporidiosis tres aspectos importantes: tratar la infección, con- trolar la diarrea y corregir la pérdida de peso, para evitar la descompensación del paciente inmunode- primido. (Contreras, 2006)(Chinchilla et al., 1998) (Lobos et al., 2005)
El tratamiento que se utiliza para E. intestinalis es albendazol con dosis recomendada de 60 mg/ día por 14 días, con excelente respuesta al trata- miento y clínicamente en la mayoría de los pacien- tes desaparece la diarrea y la eliminación de espo- ras por heces y orina, además se ha comprobado a través de biopsias del intestino delgado que las esporas desaparecen en el tejido, existen otros tratamientos que, aún están en pruebas, como la
fumagalina, derivados de imidazoles, entre otros. (Contreras, 2006) (Koltai & Researcher, 2011) (Ve- lez, 2005)(MSP, 2012)
El diagnóstico de Microsporidios en el laborato- rio microbiológico resulta complejo debido al tama- ño pequeño de las esporas, los especímenes que se utilizan para realizar un diagnóstico acertado son: materia fecal, líquido bronco alveolar, biopsia de vellosidades intestinales y sedimento urinario, fluido duodenal- yeyunal que se puede obtener por aspirado colónico las muestras se pueden procesar por diferentes métodos con tinciones por micros- copía óptica, sin embargo se requieren técnicas de microscopía electrónica de transmisión para obser- var las formas ultra estructurales de Microsporidios, también, son de gran aporte los métodos inmuno enzimáticos, inmunofluorescencia con blanco de calco flúor o anticuerpos monoclonales específi- cos, las tinciones siendo las más utilizadas para el diagnóstico de estos microorganismos. (Winn et al., 2008) (Acha & Szyfres, 2001b)
Fucsina fenicada y Tricrómica modificada por Di- dier, Weber, Ryan, Gram Chromotropo, hematoxili- na-eosina, Es importante recalcar que los labora- torios de menor complejidad pueden pasar por alto la enfermedad por falta de equipos de tecnología de punta que no son fácil de adquirir por el cos- to elevado. Existen en la actualidad otras pruebas como la técnica de Western Blot y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) considerados por el Centro para el Control y Prevención de enferme-
dades (CDC) como los métodos de referencia para la identificación de Microsporidium. (Lobos et al., 2005)(Bedoya et al., 2008)
Los métodos de tinciones son importantes para el diagnóstico rápido y oportuno en la identificación de Microsporidios, pero no son específicas para el diagnóstico de especies de este microorganismo, se realiza un frotis de heces y de otras muestras clínicas a las cuales, se las tiñen de acuerdo a la coloración que se ajuste a las necesidades de la investigación. Actualmente, se usan diferentes téc- nicas de tinción que están disponibles para el diag- nóstico de estos microorganismos como la tinción histológica de Hematoxilina-Eosina, el proceso se realiza sobre secciones de tejido fijadas en forma- lina o parafina, colorante de contraste de Weber, Ryan, Fascina fenicada y Tricrómica modificada por Didier y Gram Chromotropo 2R. (Fernández Vadi- llo, 2014)
Esta técnica se recomienda para el análisis de muestras de heces para identificar coccidios y es- poras de Microsporidium sp. El procedimiento a se- guir es el siguiente:
Realizar un frotis, dejar secar y cubrir con fucsina fenicada de Kinyoun durante 10 mi- nutos.
lavar con agua destilada para retirar el colo- rante.
Decolorar por 30 segundos con alcohol áci- do clorhídrico.
Lavar con agua destilada.
Cubrir el frotis con solución Tricrómica por 30 minutos a 37 °C.
Lavar con agua destilada.
Decolorar por 10 segundos con alcohol áci- do acético.
Lavar el frotis durante 30 segundos usando
etanol al 95 %.
Dejar secar la placa y observar al microsco- pio con aceite de inmersión en lente de 100x, la presencia de esporas que miden de 1 a 2,5 μm
Para el control de calidad se utiliza cepas de My- cobacterium tuberculosis como control positivo se preparan frotis y se tiñen con los reactivos prepara- dos para verificar que los microorganismos tomen el color adecuado (rojo-fucsia). (Gil, 2019)
Esta es una tinción alternativa al procedimiento de tinción Chromotropo, es un método fácil, confia- ble y simple de teñir en un frotis y demostrar la pre- sencia de esporas de Microsporidios en heces, ori- na, esputo, saliva, sobrenadante de cultivo celular y otras muestras clínicas, es importante recalcar, que para muestras fijadas con formol, o tejido en bloques de parafina, se debe remover la parafina, e hidratar la muestra en secuencia de alcoholes has- ta llegar al agua, para así teñirlas con la tinción de Gram. (Figura. 2)
Chromotropo 2R 1.0 g
Verde brillante SF. 0.15 g Ácido fosfotúngstico 0.25 g Ácido acético glacial 3.0 ml
Mezcle los ingredientes y dejar en reposo por 30 minutos, agregar 100 ml de agua destilada. Se debe Preparar cada mes para tener una tinción fresca.
Etanol al 90% 995.5 ml Ácido acético glacial 4.5 ml
Importante: Además de los reactivos necesa- rios para la tinción de Gram Chromotropo, se ne- cesita de un método para calentar los reactivos a una temperatura específica, por cuanto la tinción Chromotropo requiere calentarse, siendo muy útil una platina caliente.
Calentar el frotis con calor ,3 veces por 1 se- gundo sobre la llama directa ó 5 minutos en una platina caliente de 50º a 60°C. Enfriar a
temperatura ambiente.
Teñir con el método de tinción de Gram, no
se procesa la tinción de safranina:
Colocar solución de violeta de genciana en la lámina y dejar en reposo por 30 segundos. Para muestras de tejido, el tiempo será de 1 minuto.
lavar suavemente la lámina con agua para eliminar la solución de violeta de genciana.
Adicionar solución de yodo Gram en la lámi- na y dejar en reposo por 30 segundos. Para muestras de tejido, el tiempo de 1 minuto.
Lavar suavemente la lámina con agua para eliminar la solución de yodo Gram.
Agregar alcohol cetona eliminar el exceso de colorante.
Enjuague la laminilla suavemente con agua fría y retire el exceso de solución decoloran- te.
Coloque la laminilla en la tinción Chromotro- po caliente (50° a 55°C) por 1 minuto cuan- do menos. Para muestra de tejidos de tejido 1min con30 segundos.
Lavar con alcohol-ácido al 90% por 3 segun- dos.
Lavar con etanol al 95% por 30 segundos.
Lavar con etanol al 100% dos veces, por 30 segundos cada proceso, se requieren dos recipientes para este paso. Dejar secar la lámina, colocar el cubreobjetos y sellar con Cytoseal60, Bálsamo de Canadá u otro se- llador.
Para muestras de tejido, es necesario, que an- tes de montar las laminillas estas sean enjuagadas brevemente en una solución de alcohol etílico al 50%, xileno al 50% por 15 segundos.
Se debe incluir en cada corrida una laminilla tes- tigo de Microsporidia conservada en formol al10%. En muestras fecales u otros especímenes, las leva- duras, se teñirán de color violeta oscuro o rojo-ro- sáceo, también se observa en las esporas una cin- ta prominente en el Ecuador con apariencia de un cinturón, diferenciándose con facilidad las esporas de Microsporidia.(Vila et al., 2009)(Botero-Garcés & Montoya-Palacio, 2002)(Forbes, 2009)
Figura 2. Esporas de Microsporidios con Tinción de Gram Chromotrope 2R
Fuente: Fotografía Pazmiño (2014)
Es una técnica sencilla que permite la observa- ción de muestras clínicas de manera rápida para detectar esporas de Microsporidios y otros microor- ganismos, así tenemos:
Se utiliza fluorescent brightener 28, Uvitex 2A y Rylux BA. Está tinción es efectiva para el diagnós- tico de Microsporidios, además el tiempo del proce- so es corto solo 15 minutos, la desventaja es que se requiere de un microscopio de inmunofluores- cencia, además, pueden dar falsos positivos con- fundiendo el microorganismo con otras levaduras o artefactos.(Noda Albelo et al., 2013)(Cuenca et al., 2006) (Figura 3)
Figura 3. Esporas de Microsporidios con Tinción Blanco
de Calcoflúor
Fuente: Fotografía Pazmiño (2014)
Realizar un frotis de la muestra, dejar secar, fijar con metanol por cinco minutos y dejar secar al aire.
Agregar la solución de Calcoflúor y dejar por
cinco minutos a temperatura ambiente.
Lavar con agua de chorro y agregar luego el colorante de contraste azul de Evans por un minuto a temperatura ambiente.
Lavar los portaobjetos con agua y dejar se- car al aire.
Observar al microscopio fluorescencia de 1000X con filtro azul violeta a 395 o 415 nm de longitud de onda.
Las esporas aparecen de color blanco azu- loso brillante sobre un fondo negro con filtro de 465 nm y verde brillante sobre un fondo negro con filtro de 450- 490 nm.
Se debe incluir en cada corrida un extendi- do testigo de Microsporidios conservados en formol al 10%
Los agentes quimio fluorescentes como el Calcoflúor, son agentes luminiscentes ópti- cos que son sensibles, pero no específicos hacen fluorescer objetos y otros organismos que no son Microsporidios dando resultados inadecuados. (Contreras, 2006)
Los anticuerpos monoclonales son un método de inmuno detección tipo sándwich, en este pro- ceso el anticuerpo (Ac) de detección en el tampón se adhiere al antígeno(Ag) presente en la muestra, formándose de esta manera el complejo Ag-Ac, posteriormente se traslada a la matriz de nitrocelu- losa donde es capturado por el Ac que se encuentra inmóvil en la tira de prueba, es importante conocer que mientras más Ag se encuentra en la muestra más fuerte es el complejo Ag-Ac que se genera, lo- grando una alta intensidad en la señal de fluores- cencia en el Ac que se va a detectar, el resultado se expresa de manera cualitativa positivo o negativo. Actualmente se distribuyen reactivos de anticuer- pos monoclonales para la identificación de Entero- cytozoon bieneusi y Encephalitozoon intestinalis. (Alonso et al., 2005)
Se han elaborado ensayos inmunoenzimáticos para la detección de anticuerpos y antígenos en muestra sanguíneas basados en las técnicas de ELISA, IFI, contra inmnoelectroforésis y Western Blot, para detectar Enterocytozoon bieneusi y En- cephalytozoon intestinalis, pero hasta el momento no se han comercializado, por lo que no existen estudios certificados que demuestren la confiabili- dad, sensibilidad y especificidad de estas pruebas diagnósticas.
Se han desarrollado métodos con anticuerpos monoclonales y policlonales para la identificación de Microsporidios a partir de muestras clínicas.
Métodos moleculares Se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa, (PCR) de manera rutina- ria y específica para el diagnóstico de Enterocyto- zoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, pue- de aplicarse sobre muestras de fluidos biológicos como heces, orina, aspirado duodenal y material de biopsia, generalmente solo se procesan en labora- torios de investigación. (Mena et al., 2021) (Forbes, 2009)(Bornay-Llinares et al., 2000)
Para ambos microorganismos se amplifica el ADN de las regiones SSU-ARNr (subunidad pe- queña del ARN ribosómico) utilizando cebadores específicos para Encephalitozoon intestinalis, SIN- TF 5’TTTCGAGTGTAAAGGAGTCGA3’, cuya po-
sición en la secuencia es de 362 a 382 y SINTR
5’CCGTCCTGCTTCTCCTGCCCG3’, posición 861
a 881, que amplifican un producto de 520 pb; y para Enterocytozoon bieneusi, EBIEF1 5’GAAAC- TTGTCC ACTCCTTACG3’, cuya posición en la secuencia es 295 a 315 y EBIER1 5’CCATGCAC- CACTCCTGCCATT3’, posición 881-901, que am- plifican 607 pb. (Botero et al., 2004) (Mena et al., 2021)
terísticas estructurales del esporoplasma y organe- las de Microsporidios.
Para estos procesos se requiere la tinción elec- trónica con acetato de uranilo al 6% y citrato de plomo, para observaciones y fotografías se pue- de utilizar el microscopio electrónico de trasmisión JOE-JEM 1010 o en HITACHI H-600. (Amano & Díaz, 2012)
Sin embargo, este sistema es costoso, toma tiempo y no es apropiado como diagnóstico de ru- tina está disponible en los laboratorios de investi- gación observándose las ultra estructuras inter- nas que permiten diferenciar una especie de otra. (Mena et al., 2021)
Existen agentes etiológicos reclasificado como especies fúngicas que son patógenos para los se- res humanos, dentro de este grupo están Entero- cytozoon bieneusi y Encephalitozoon intestinalis que producen diarrea crónica y constituyen un fac- tor de riesgo para los pacientes VIH-SIDA, trasplan- tados y cáncer.
Las tinciones para observar por microscopía óp- tica simple, ayudan para un diagnóstico rápido y oportuno, por lo tanto, es esencial que los técnicos dominen los procesos tintoriales y puedan diferen- ciar claramente las estructuras morfológicas de Mi- crosporidios gastrointestinal.
Las técnicas de inmunofluorescencia con mar- cadores específicos con anticuerpos monoclonales para Enterocytozoon bieneusi y Encephalitozoon intestinalis son de gran utilidad para el diagnósti- co de los dos microorganismos, Las pruebas de RT- PCR y Microscopía electrónica de trasmisión (TEM), pero estas técnicas solo se utilizan en los laboratorios de alta complejidad dedicados a la in- vestigación por el alto costo, por ese motivo no se pueden adquirir en los laboratorios de menor com- plejidad, sin embargo, estos métodos deben ser estandarizados en cada laboratorio de referencia.
Las Industrias farmacéuticas deben innovar la producción de medicamentos específicos para Microsporidios, siendo de vital importancia para la toma de decisiones de los médicos en el uso adecuado del tratamiento terapéutico contra es- tos microorganismos que afectan a los pacientes VIH-SIDA,
Acha, P., & Szyfres, B. (2001a). Bacteriosis y Mi- cosis. Zoonosis y Enfermedades Transmisibles Comunes Al Hombre y a Los Animales, 580, 266– 283.
Acha, P., & Szyfres, B. (2001b). Zoonosis y En- fermedades Transmisibles Comunes al Hombre y a Los Animales. Volumen I: Bacteriosis y Mi- cosis. Organización Panamricana de La Salud, 1(580), 76–252. https://doi.org/10.1590/S1135-
57272001000300009
Acurero, E., Maldonado, A., Olmos, G., Rivero, Z., Bracho, A., Calchi, M., Avila, A., & Arraiz, N. (2015). Intestinal Microsporidiosis Prevalence in Children With Severe Malnutrition at a Hospital in the City of Maracaibo. Kasmera. https://www. researchgate.net/publication/313577157_Intes- tinal_Microsporidiosis_Prevalence_in_Children_ With_Severe_Malnutrition_at_a_Hospital_in_ the_City_of_Maracaibo
Alonso, C., Bartolomé, R., Matas, L., Domingues, J., Mata, L., & Rabella, N. (2005). Técnicas rápi- das de detección de antigeno. Sociedad Españo- la de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
Amano, Y., & Díaz, L. (2012). Introducción a la Mi- croscopía Electrónica, principios-aplicaciones (2nd ed.). Instituto Nacional de Higiene y Medici- na Tropical.
Bedoya, K., Montoya, M. N., Botero, J., & Galván,
A. L. (2008). Primer aislamiento de Encephalito- zoon intestinalis a partir de muestra de materia fecal de un paciente colombiano con sida [JOUR]. In Biomédica (Vol. 28, pp. 441–447). Scielo.
Bigliardi, E., & Sacchi, L. (2001). Cell biology and invasion of the microsporidia. Microbes and In- fection, 3(5), 373–379. https://doi.org/10.1016/ S1286-4579(01)01393-4
Bornay-Llinares, F. J., Acosta, B., Peman, J., Moura, H., Schwartz, D. A., Da Silva, A. J., Visvesvara, G. S., Figueras, M. J., Gobernado, M., & Pieniazek,
N. J. (2000). Mantenimiento en cultivo y carac- terización de un microsporidio (Encephalitozoon hellem) aislado en un paciente con Sida y neumo- nía. Parasitología Al Día, 24(3–4), 69–70. https:// doi.org/10.4067/S0716-07202000000300001
Botero-Garcés, J., & Montoya-Palacio, M. N. (2002). Microsporidiosis intestinal: una visión integral. In- fectio, 6(4), 213–225.
Botero, J. H., Montoya, M. N., Vanegas, A. L., Díaz, A., Navarro-i-Martínez, L., Bornay, F. J., Izquier- do, F., del Aguila, C., & Agudelo, S. del P. (2004). Frequency of intestinal microsporidian infections in HIV-positive patients, as diagnosis by quick hot Gram chromotrope staining and PCR. Biomédica, 24(4), 375–384. https://doi.org/10.7705/BIOME- DICA.V24I4.1287
CDC. (2019). Microsporidiosis- Identificación de laboratorio de parásitos de interés para la salud pública. Centros Para El Control y La Prevención de Enfermedades. https://www.cdc.gov/dpdx/mi- crosporidiosis/index.html
Chacin-Bonilla, L., Panunzio, A. P., Monsalve-Cas- tillo, F. M., Parra-Cepeda, I. E., & Martinez, R. (2006). Microsporidiosis in Venezuela: prevalence of intestinal microsporidiosis and its contribution to diarrhea in a group of human immunodeficien- cy virus-infected patients from Zulia State. The American Journal of Tropical Medicine and Hy- giene, 74(3), 482–486. http://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/16525110
Chinchilla, M., Lilliana, R., Olga, G., Alfredo, C., Lilliana, G., Marta, O., & Castro C, A. (1998). Microsporidiosis: una parasitosis de reciente adaptación al hombre. Revista Costarricense de Ciencias Médicas, 19(3–4), 209–221. https:// www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttex- t&pid=S0253-29481998000300010#3
Contreras, K. (2006). Investigación de la presencia de Microsporidios en heces de niños desnutridos en Guatemala utilizando tres métodos diagnósti- cos de tinción. In Tesis.
Cuenca, M., Gadea, I., Martín, E., Pemán, J., Pon- tón, J., & Rodríguez, J. (2006). Diagnóstico mi- crobiológico de las micosis y estudios de sensi- bilidad a los antifúngicos. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clíni- ca. http://coesant-seimc.org/documents/Sensibili- dad_Antifungicos.pdf
Da Silva, A. J., Slemenda, S. B., Visvesvara, G. S., Schwartz, D. A., Mel Wilcox, C., Wallace, S., & Pieniazek, N. J. (1997). Detection of Septata intestinalis (microsporidia) cali et al. 1993 us- ing polymerase Chain reaction primers targeting the small subunit ribosomal RNA coding region. Molecular Diagnosis, 2(1), 47–52. https://doi. org/10.1016/S1084-8592(97)80010-0
De Moura, M. L. C., Alvares-Saraiva, A. M., Pé- rez, E. C., Xavier, J. G., Spadacci-Morena, D. D., Moysés, C. R. S., Rocha, P. R. D., & Lallo, M.
A. (2019). Cyclophosphamide treatment mimics sub-lethal infections with encephalitozoon intes- tinalis in immunocompromised individuals. Fron- tiers in Microbiology, 10(SEP), 2205. https://doi. org/10.3389/FMICB.2019.02205/BIBTEX
Decraene, V., Lebbad, M., Botero-Kleiven, S., Gus- tavsson, A. M., & Löfdahl, M. (2012). First reported foodborne outbreak associated with microsporid- ia, Sweden, October 2009. Epidemiology and In- fection, 140(3), 519–527. https://doi.org/10.1017/ S095026881100077X
Delbac, F., & Polonais, V. (2008). The microsporid- ian polar tube and its role in invasion. Sub-Cel- lular Biochemistry, 47, 208–220. https://doi. org/10.1007/978-0-387-78267-6_17
Desportes, I., Charpentier, Y. Le, Galian, A., Bernard, F., Cochand-Priollet, B., Lavergne, A., Ravisse, P., & Modigliani, R. (1985). Occurrence of a New Microsporidan: Enterocytozoon bieneusi ng, n. sp., in the Enterocytes of a Human Patient with AIDS. The Journal of Protozoology, 32(2), 250– 254. https://doi.org/10.1111/j.1550-7408.1985. tb03046.x
Didier, E. S., & Weiss, L. M. (2006). Microspo- ridiosis: current status. Current Opinion in In- fectious Diseases, 19(5), 485–492. https://doi. org/10.1097/01.qco.0000244055.46382.23
Didier, P. J., Phillips, J. N., Kuebler, D. J., Nasr, M.,
Brindley, P. J., Stovall, M. E., Bowers, L. C., & Di- dier, E. S. (2006). Antimicrosporidial activities of fumagillin, TNP-470, ovalicin, and ovalicin deriva- tives in vitro and in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50(6), 2146–2155. https://doi. org/10.1128/AAC.00020-06
Fernández, N., Combol, A., Zanetta, E., Acuña, A. M., & Gezuele, E. (2002). Primer diagnostico de microsporidiosis humana in Uruguays. Rev Med Uruguay, 18(3), 251–255.
Fernández Vadillo, C. (2014). Desarrollo de anti- cuerpos monoclonales frente a Nosema ceranae como aportación al diagnóstico del síndrome de despoblamiento. Universidad Complutense De Madrid, 225.
Fiuza, V. R. da S., Lopes, C. W. G., Cosendey,
R. I. J., de Oliveira, F. C. R., Fayer, R., & San- tín, M. (2016). Zoonotic Enterocytozoon bieneu- si genotypes found in brazilian sheep. Research in Veterinary Science, 107, 196–201. https://doi. org/10.1016/J.RVSC.2016.06.006
Forbes, B. A. (2009). Diagnóstico Microbiológico. In Panamericana (Ed.), Panamericana (12va ed.). Panamericana.
Franzen, C. (2008). Microsporidia: A Review of 150 Years of Research. The Open Par- asitology Journal, 2(1), 1–34. https://doi. org/10.2174/1874421400802010001
Franzen, Caspar. (2004). Microsporidia: how can they invade other cells? Trends in Parasitolo- gy, 20(6), 275–279. https://doi.org/10.1016/J. PT.2004.04.009
Fresnadillo, M., García, E., & García, J. (2010). Introducción a la protozoología clínica II (Filos Apicomplexa y Microsporidia). http://hdl.handle. net/10366/83398
Galván, A. L., Sánchez, A. M. M., Valentín, M. A. P., Henriques-Gil, N., Izquierdo, F., Fenoy, S., & Del Aguila, C. (2011). First cases of microsporidiosis in transplant recipients in spain and review of the literature. Journal of Clinical Microbiology, 49(4), 1301–1306. https://doi.org/10.1128/JCM.01833-
10
Ghoshal, U., Khanduja, S., Pant, P., & Ghoshal, U.
C. (2016). Evaluation of Immunoflourescence an- tibody assay for the detection of Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon intestinalis. Parasi- tology Research, 115(10), 3709–3713. https://doi. org/10.1007/S00436-016-5130-2
Gil, M. (2019). Tinción de Kinyoun: fundamento y técnicas. Lifeder. https://www.lifeder.com/tin- cion-de-kinyoun/
Gómez Puerta, L. A. (2013). Caracterización mole- cular de genotipos de Enterocytozoon bieneusi y ensamblajes de Giardia duodenalis aislados de heces de cías de alpaca (Vicugna pacos). Tesis UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS, 120.
Gool, T. Van, Canning, E. U., Gilis, H., Weerman, M.
A. V. D. B., Schattenkerk, J. K. M. E., & Dankert,
J. (1994). Septata intestinalis frequently isolated from stool of AIDS patients with a new cultivation method. Parasitology, 109(3), 281–289. https:// doi.org/10.1017/S0031182000078318
Halánová, M., Valenčáková, A., Jarčuška, P., Halán, M., Danišová, O., Babinská, I., Dedinská, K., & Čisláková, L. (2019). Screening of opportunistic encephalitozoon intestinalis and enterocytozoon bieneusi in immunocompromised patients in Slo- vakia. Central European Journal of Public Health, 27(4), 330–334. https://doi.org/10.21101/cejph. a5407
Han, B., Pan, G., & Weiss, L. M. (2021). Microspo- ridiosis in Humans. Clinical Microbiology Reviews, 34(4). https://doi.org/10.1128/CMR.00010-20
Han, B., Takvorian, P. M., & Weiss, L. M. (2020). Invasion of Host Cells by Microsporidia. Frontiers in Microbiology, 11, 172. https://doi.org/10.3389/ FMICB.2020.00172/BIBTEX
Han, B., & Weiss, L. M. (2017). Microsporidia: Ob- ligate Intracellular Pathogens within the Fungal Kingdom. Microbiology Spectrum, 5(2). https:// doi.org/10.1128/MICROBIOLSPEC.FUNK-0018- 2016
Koltai, T., & Researcher, I. (2011). Manual de Biolo- gía Molecular: Técnicas de Laboratorio. In Reser- chGate (Issue May).
Kotler, D., & Orenstein, J. (1999). Clinical syndromes associated with microsporidiosis. In American & Society of Microbiology (Eds.), American Society of Microbiology (pp. 258–292). The Microsporidia and Microsporidiosis. https://socgenmicrobiol.org. uk/pubs/micro_today/book_reviews/MTNOV99/ MTN99_07.cfm
Kotler, D. P., & Orenstein, J. M. (1998). Clinical sy- ndromes associated with microsporidiosis. Ad- vances in Parasitology, 40, 321–349. https://doi. org/10.1016/S0065-308X(08)60126-8
Kwon, J. Y., Seo, J. Y., Kim, T. Y., Lee, H. Il, & Ju, J.
W. (2021). First Identification and Genotyping of Enterocytozoon bieneusi and Prevalence of En- cephalitozoon intestinalis in Patients with Acute Diarrhea in the Republic of Korea. Pathogens (Ba- sel, Switzerland), 10(11). https://doi.org/10.3390/ PATHOGENS10111424
Lobos, J., Parrilla, A., Guerra, G., Larios, P., & Bustos, M. (2005). Capacidad para el diagnós- tico microscópico de ¨Criptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Blastocystis hominis, Isospora belli, Encephalocytozoon intestinales y Enterocytozoon bieneusi¨. Tesis. https://bibliote- ca.medicina.usac.edu.gt/tesis/pre/2005/025.pdf
Lores, B., López-Miragaya, I., Arias, C., Fenoy, S., Torres, J., & Del Aguila, C. (2002). Intestinal mi- crosporidiosis due to Enterocytozoon bieneusi in elderly human immunodeficiency virus--negative patients from Vigo, Spain. Clinical Infectious Dis- eases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America, 34(7), 918–921. https://doi.org/10.1086/339205
lvarado G., J., González Z., A., Gillman, R., & López U., T. (2009). Infección experimental de cerdos de un mes de edad con esporas de En- terozytozoon bieneusi. Revista de Investigacio- nes Veterinarias Del Perú, 291–296. http://www.
scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pi- d=S1609-91172009000200021
Madrid, V., Fernendez, I., & Torrejon, E. (2012). Ma- nual de parasitología Humana. In Universidad de Concepción: Vol. ث.
Marchant, C. (2006). “Pesquisa de la presencia de Encephalitozoon cuniculi en conejos.” Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias Escuela de Ciencias Veterinarias.
Matos, O., Lobo, M. L., & Xiao, L. (2012). Epide- miology of Enterocytozoon bieneusi Infection in Humans. Journal of Parasitology Research, 2012. https://doi.org/10.1155/2012/981424
Mena, C. J., Barnes, A., Castro, G., Guasconi, L., Burstein, V. L., Beccacece, I., Paulin, P. C., Ar- neodo, J., Carnevale, S., Astudillo, G., Cervi, L., Theumer, M. G., & Chiapello, L. S. (2021). Micro- scopic and PCR-based detection of microsporidia spores in human stool samples. Revista Argenti- na de Microbiología, 53(2), 124–128. https://doi. org/10.1016/J.RAM.2020.04.005
Ministerio_de_Salud_Argentina. (2001). Guía de Prevención, Procedimiento, Diagnóstico y Tra- tamiento de Parasitosis, incorporándola al Pro- grama Nacional de Garantía de Calidad de la Atención Médica. https://www.argentina.gob.ar/ normativa/nacional/resolución-898-2001-68931/ texto
Moncada, L., & Pérez, G. R. De. (1998). Microspo- ridios en humanos. 18(3), 199–215.
Moniot, M., Poirier, P., & Nourrisson, C. (2021). Etymologia: Enterocytozoon bieneusi. Emerg- ing Infectious Diseases, 27(6), 1587. https://doi. org/10.3201/EID2706.ET2706
Morán, F., & Ochoa, T. J. (2017). PREVENTION, DIAGNOSIS, AND TREATMENT OF PEDIAT- RIC INFECTIONS DURING NATURAL DISAS-
TERS. 34(4), 723–753. https://doi.org/10.17843/
rpmesp.2017.344.2810
MSP. (2012). Protocolos Terapéuticos. Ministerio de Salud Pública, 1–370. https://eliochoa.files.wor- dpress.com/2014/05/guias-msp-protocolo-mane- jo.pdf
Murray, P. R., S;, R. K., & Pfaller, M. A. (2021). Mi- crobiología Médica (Elsevier (ed.); 9na ed.). El- sevier.
Neil A., Camphell J., R. B. (2017). Biología (Pana- mericana (ed.); 7ma ed.).
Nétor Velásquez, J., Marta, E., Alicia di Risio, C., Et-
chart, C., Gancedo, E., Victor Chertcoff, A., Bruno
Malandrini, J., Germán Astudillo, O., & Carneva- le, S. (2012). Molecular identification of protozoa causing AIDS-associated cholangiopathy in Bue- nos Aires, Argentina. Acta Gastroenterologica La- tinoamericana, 42(4), 301–308. https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/23383524/
Noda, A., Cañarte, R., & Pérez, K. (2013). Revista médica electrónica. In Revista Médica Electróni- ca (Vol. 35, Issue 2). Centro Provincial de Infor- mación de Ciencias Médicas de Matanzas. http:// scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pi- d=S1684-18242013000200008
Noda Albelo, A. L., Cañete, R., & Brito Pérez, K. (2013). Microsporidiosis gastrointestinal: una ac- tualización. Revista Médica Electrónica, 35(2), 167–181.
Ojuromi, O. T., Izquierdo, F., Fenoy, S., Fagbenro-Be- yioku, A., Oyibo, W., Akanmu, A., Odunukwe, N., Henriques-Gil, N., & Del Aguila, C. (2012). Iden- tification and Characterization of Microsporidia from Fecal Samples of HIV-Positive Patients from Lagos, Nigeria. Plos One. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0035239
OMS/OPS. (2000). Pautas para la prevención de infecciones oportunistas en personas con VIH o sida en América Latina y el Caribe. OMS/OPS.
OPS/OMS. (2003). Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre ya los anima- les. OPS, III(580), 53–72.
OPS/OMS. (2022). TRATAMIENTO DE LAS EN- FERMEDADES INFECCIOSAS. MANUAL
OPS. https://iris.paho.org/bitstream/hand- le/10665.2/51695/9789275321133_spa.pdf?se- quence=9
Pazmiño, B., Rodas, E., Rodas, J., Zambrano, R., Davila, A., Matini, L., Pazmiño, C., & Díaz, L. (2014). Microsporidium spp. En Pacientes VIH Positivos con Síndrome Diarreico Atendidos en el Hospital de Infectología “Dr. José Daniel Rodrí- guez” de Guayaquil, Abril – Junio, 2013. Revista Universidad de Giayaquil, 17. http://www.ug.edu. ec/revistas/Revista_Ciencias_Medicas/REVIS- TA_N2_VOL17/Revista_2-201_Original_2.pdf
Pearson, R. D. (2020). Generalidades sobre las in- fecciones por protozoos intestinales y microspo- ridios - Enfermedades infecciosas - Manual MSD versión para profesionales. Manual MSD. ht- tps://www.msdmanuals.com/es-ec/professional/ enfermedades-infecciosas/protozoos-intestina- les-y-microsporidias/generalidades-sobre-las-in- fecciones-por-protozoos-intestinales-y-microspo- ridios
Romero Cabello, R. (2018). Microbiología y Para- sitología Humana (Panamericana (ed.); 4th ed.).
Salát, J., & Braunfuchsová, P. (2002). Encephali- tozoon cuniculi and Encephalitozoon intestina- lis--causes of opportunistic infections. Epidemiolo- gie Mikrobiologie Imunologie Casopis Spolecnosti pro Epidemiologii a Mikrobiologii Ceske Lekarske Spolecnosti JE Purkyne.
Santín, M., Calero-Bernal, R., Carmena, D., Mateo, M., Balseiro, A., Barral, M., Lima Barbero, J. F., & Habela, M. Á. (2018). Molecular Characterization of Enterocytozoon bieneusi in Wild Carnivores in Spain. Journal of Eukaryotic Microbiology, 65(4), 468–474. https://doi.org/10.1111/jeu.12492
Shadduck, J. A., & Orenstein, J. M. (1993). Compar- ative pathology of microsporidiosis. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 117(12), 1215–
1219. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8250691/ Snowden, K. F., Didier, E. S., Orenstein, J. M., &
Shadduck, J. A. (1998). Animal models of human
microsporidial infections. Laboratory Animal Sci- ence, 48(6), 589–592. https://pubmed.ncbi.nlm. nih.gov/10090081/
Stentiford, G. D., Becnel, J. J., Weiss, L. M., Keel- ing, P. J., Didier, E. S., Williams, B. A. P., Bjorn-
son, S., Kent, M. L., Freeman, M. A., Brown, M.
J. F., Troemel, E. R., Roesel, K., Sokolova, Y., Snowden, K. F., & Solter, L. (2016). Microsporidia
– Emergent Pathogens in the Global Food Chain. Trends in Parasitology, 32(4), 336. https://doi. org/10.1016/J.PT.2015.12.004
Van Gool, Tom, Vetter, J. C. M., Weinmayr, B., Van Dam, A., Derouin, F., & Dankert, J. (1997). High seroprevalence of Encephalitozoon species in immunocompetent subjects. The Journal of Infec- tious Diseases, 175(4), 1020–1024. https://doi. org/10.1086/513963
Vasquez, O., Jimenez, R., Martinez, I., Ruiz, A., & Garcia, Y. (1997). Frecuencia de Cryptospo- ridium, Cyclospora y Enterocytozoon en pa- cientes pediátricos con diarrea. In Patologia Clinica de Mexico. https://books.google.com. ec/books?id=MMER1D9JVLIC&pg=PP35&lpg=- PP35&dq=estadistica+mundial+de+enterocyto- zoon+bieneusi&source=bl&ots=tM3PhJ4NyY&- sig=ACfU3U1GGD4ZCP2sVvUZ2O1OuvQFfvX-
7BQ&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwjCgKP5qK- T2AhVwRzABHekUBZUQ6AF6BAhCEAM#v=o-
nepage&q=es
Velásquez, J. N., Carnevale, S., Guarnera, E. A., Labbé, J. H., Chertcoff, A., Cabrera, M. G., & Ro- dríguez, M. I. (1996). Detection of the microspo-
ridian parasite Enterocytozoon bieneusi in speci- mens from patients with AIDS by PCR. Journal of Clinical Microbiology.
Velez, H. (2005). Fundamentos de Medicina Manual del VIH/SIDA y otras Infecciones de Transmision Sexual | Ediciones Técnicas Para- guayas. https://www.etp.com.py/libro/fundamen- tos-de-medicina-manual-del-vihsida-y-otras-in- fecciones-de-transmision-sexual-64794.html
Vergneau-Grosset, C., & Larrat, S. (2015). Mi- crosporidiosis in Vertebrate Companion Exotic Animals. Journal of Fungi 2016, Vol. 2, Page 3,
2(1), 3. https://doi.org/10.3390/JOF2010003
Vesga, O., Vélez, L., Leiderman, E., & Restrepo, Á. (2015). Enfermedades infecciosas de Homo sa- piens. Kasmera.
Vila, J., Álvarez-Martínez, M. J., Buesa, J., & Cas- tillo, J. (2009). Diagnóstico microbiológico de las infecciones gastrointestinales. Enfermedades In- fecciosas Y Microbiologia Clinica, 27(7), 406. ht- tps://doi.org/10.1016/J.EIMC.2008.11.009
Weber, R., Bryan, R. T., Schwartz, D. A., & Owen, R.
L. (1994). Human microsporidial infections. Clini- cal Microbiology Reviews, 7(4), 426–461. https:// doi.org/10.1128/CMR.7.4.426
Weiss, L. M., & Becnel, J. J. (2014). Microsporidia : pathogens of opportunity.
Winn, Allen, Janda, Koneman, & Procop. (2008).
Diagnóstico microbiológico (Panamericana (ed.)). Staphylococcus aureus (MRSA) from Japane-
se children’s oral cavities. Pediatric Dent J;
17(2):127-130.
Vieira A, Hiller N, Powell E, Hak‐Jin L, Spirk T, Modesto A, Kreft R. (2019). Profiling microorgan- isms in whole saliva of children with and without dental caries. Clin Exp Dent Res;1-9.
Waleed AA. (2019). Detection of the Panton-Valen- tine Leukocidin Gene in Swedish Isolates of Meth- icillin-Resistant Staphylococcus aureus using a Multiplex PCR Assay. Journal of Bacteriology and Parasitology. J Bacteriol Parasitol; 153(3): 215-8.
Wang Y, Liu S, Li B, Jiang Y, Zhou X, Chen J, Li M, Ren B, Peng X, Zhou X, Cheng L. (2019). Staph- ylococcus aureus induces COX-2-dependent pro- liferation and malignant transformation in oral ke- ratinocytes. J Oral Microbiol; 11:1-12.