Invest Clin 59(4): 352 - 368, 2018 https://doi.org/10.22209/IC.v59n4a06
Biocompatibilidad y toxicidad de nanopartículas de dióxido de titanio
en la cavidad oral: Revisión sistemática.
Liliana Argueta-Figueroa1, Nayely Torres-Gómez2 , Rogelio J. Scougall-Vilchis3 y René García-Contreras4
1Cátedra CONACyT, Facultad de Odontología, Universidad Autónoma Benito Juárez de Oaxaca, Oaxaca, México.
2Centro Conjunto de Investigación en Química Sustentable (CCIQS), UEAMex-UNAM. Km 14.5, Carr. Toluca-Atlacomulco, Toluca, Estado de México, México.
3Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Odontología (CIEAO) “Dr. Keisaburo Miyata”, Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex), Toluca, México. 4Laboratorio de Investigación Interdisciplinaria (LII), Área de Nanoestructuras
y Biomateriales, Escuela Nacional de Estudios Superiores Unidad León; Universidad Nacional Autónoma de México; León, Guanajuato, México.
2
2
2
disponibles sobre las NPs de TiO
fueron recopilados de la base de datos electrónica
2
PubMed, ScienceDirect y otras fuentes, de acuerdo con recomendaciones PRISMA para revisiones sistemáticas. En el análisis cualitativo de la información publicada sobre la citotoxicidad en células orales, se ha observado un ligero aumento en el número de células metabólicamente activas al estar en contacto con las NPs de TiO ; sin embargo a ciertas dosis la viabilidad celular decrece de manera importan-
2
te. Uno de los efectos negativos de las NPs de TiO
es la inducción de producción de
2
prostaglandina E
en un estado proinflamatorio previo, lo que potenciaría el efecto
inflamatorio ya existente. Por tal motivo, la aplicación biológica de estas NPs debe ser sujeta a estudios in vivo y metabolómicos, ya que es posible que los resultados de los experimentos in vitro no puedan ser extrapolados a un sistema in vivo debido a la tendencia a agregarse en el medio de cultivo empleado para dichas pruebas. Por lo tanto, aunque puede clasificarse como un material con citotoxidad ligera o incluso biocompatible, no puede ser considerado complemente inocuo.
Autor de correspondencia: René García-Contreras. Laboratorio de Investigación Interdisciplinaria (LII), Área de Nanoestructuras y Biomateriales, Escuela Nacional de Estudios Superiores Unidad León; Universidad Nacional Au- tónoma de México; León, Guanajuato, México. e-mail: dentist.garcia@gmail.com
Biocompatibility and nanotoxicology of titanium dioxide in the oral cavity: Systematic review.
Invest Clin 2018; 59 (4): 352 - 368
2
oxidative stress.
2
cal impact and toxicology of titanium dioxide nanoparticles (TiO
NPs) to deter-
mine their cytotoxicity, reactive oxygen species production as well as induction of oxidative stress through a systematic review of the literature published so far
2
about the biocompatibility of TiO
NPs in contact with oral cells. Available data
on nanoparticles (NPs) were collected from the PubMed and Science Direct electronic databases, and other sources according to PRISMA recommenda- tions for systematic reviews. In the qualitative analysis of published data on cytotoxicity in oral cells, a slight increase in the number of metabolically active
2
cells has been observed when the TiO
NPs are in contact with oral cells; how-
ever, at certain doses cellular viability decreases significantly. One of the nega-
2
tive effects of NPs is the induction of prostaglandin E
production in a previous
pro-inflammatory state, which could increase the existing inflammatory effect. Therefore, the biological application of these nanoparticles must be performed both in vivo and metabolomic studies, since it is possible that the results of the in vitro experiments cannot be extrapolated to an in vivo system, since it been observed that the particles tend to aggregated among them, in the culture medium, used for such as tests. Therefore, although it can be considered a ma- terial with light or even biocompatible cytotoxicity, it must not be considered completely harmless.
Recibido 14-11-2017 Aceptado 25-10-2018
La nanotecnología consiste en la mani- pulación de materiales con dimensiones que van de 1 a 100 nanómetros (nm) (1). A me- dida que las partículas son más pequeñas, su área de superficie se vuelve exponencialmen- te más grande y, por lo tanto, las NPs son más reactivas (2).
2
Debido a su afinidad al oxígeno y otros elementos, el titanio (Ti) no existe en su forma metálica en la naturaleza. El dióxido de titanio (TiO ) es un compuesto mineral
que se encuentra en tres diferentes estruc- turas cristalinas polimórficas: anatasa, ruti- lo y brookita. Se ha reportado que la anatasa (tamaño promedio=3-5 nm; dosis=100mg/ mL) es químicamente más reactiva y genera seis veces más especies reactivas de oxíge- no [por sus siglas en inglés, reactive oxygen species (ROS)] que el rutilio después de su irradiación con luz UV, por lo que la fase ana- tasa podría poseer mayor potencial citotóxi- co (9). Sin embargo, las ROS generadas por dicha fase no se producen bajo condiciones de luz visible (3,4).
Debido a su coloración, las nanopartícu-
geno (posible carcinógeno para humanos)
2
las (NPs) de TiO
se han utilizado en pigmen-
(17). Un aspecto que debe tomarse en con-
2
tos farmacéuticos, cosméticos, productos para el cuidado de la piel y para el cuidado personal tales como protectores solares y pas- tas dentales, esto debido también a su capa- cidad para atravesar barreras biológicas. Los protectores solares y pastas dentales contie- nen del 1% al 10% aunque existen productos con concentraciones por debajo de 0,01 mg/ mL (5). En el campo de la medicina, se ha re- portado el uso de diversas NPs como acarrea- doras para liberación de fármacos (6), para tratamiento del cáncer (7), detección (8), diagnóstico (9) y otros tratamientos terapéu- ticos (10). Específicamente, las NPs TiO se han utilizado como un potencial agente foto- sensibilizador en terapia fotodinámica (11) y como componente de las partes articulares de prótesis, especialmente para cadera y ro- dilla (12); sin embargo, dichas prótesis, en ocasiones fracasan debido a la degradación de los materiales o a la respuesta inflamatoria crónica en el tejido que las rodea (13).
Por otro lado, se está investigando su
sideración, es que las NPs poseen un tamaño diminuto, el cual facilita su incorporación a las células por vía de endocitosis (18) y una vez que las NPs han traspasado la membra- na, pueden afectar las funciones celulares e inducir la muerte. Existe cierta controversia sobre la biocompatibilidad de dichas NPs; al- gunos estudios muestran que la inhalación e ingesta de estas es segura sin causar efectos adversos (19), mientras que otros reportes señalan que incrementan el riesgo a desarro- llar asma en las crías de ratones expuestos a inhalarlas (20). Además, se ha encontrado que causan efectos citotóxicos en contacto con tejido cardiaco (21) y hemaglutinación y hemólisis celular en cultivo con eritroci- tos (22). En cambio, algunos estudios en otro tipo de líneas celulares reportan que el contacto con células epiteliales alveolares (8A549), células epiteliales bronquiales (16- HBE), monocitos/macrófagos (THP-1), y macrófagos alveolares de ratón no producen citoxicidad, ni reducción del número de cé-
2
uso como preparados de NPs de TiO
en va-
lulas viables (23). Por otro lado, las NPs, en
rios productos del cuidado de la piel para tratar acné vulgaris, dermatitis atópica, le- siones hiperpigmentadas de la piel, condilo- ma acuminado recurrente, entre otras (14).
dosis mayores a 1 mg/L muestran citotoxici- dad por acción pro-oxidante en contacto de fibroblastos de ratón y de humano (24). Las condiciones para la evaluación nanotoxicoló-
2
Asimismo, las NPs de TiO
también parecen
gica in vitro pueden verse en la Tabla I.
mostrar actividades antibacteriales bajo ra- diación ultravioleta (15), ampliando así su aplicación en este campo. Tradicionalmente,
En odontología, la utilización de las NPs es un campo potencial para el desarro- llo de nuevos materiales de restauración,
2
las partículas de TiO
se han considerado
implantes dentales, irrigación de conduc-
como inertes, debido a esto, se han utiliza- do como “control negativo” en muchos es- tudios toxicológicos de partículas tanto in vitro como in vivo. Actualmente, esta visión ha cambiado tras observar el desarrollo de tumores pulmonares cancerígenos en ratas
tos, entre otras, debido a sus propiedades antibacteriales y terapéuticas (25)including dental practice with the development of sil- ver nanoparticles (Ag NPs). Recientemente, diversos materiales dentales han incluido NPs en su composición. Por ejemplo, se han
después de dos años de exposición a concen-
2
incorporado NPs de TiO
a cementos de io-
2
traciones altas de partículas finas de TiO (16). Por lo que la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer [por sus siglas en inglés, International Agency for Research on Cancer (IARC)], ha clasifi-
nómero de vidrio, las cuales incrementan significativamente su resistencia a la flexión y compresión así como su microdureza y su efecto antibacterial, además de no interferir con la adhesión de estos con los tejidos den-
2
cado al TiO
dentro del grupo 2B carcinó-
tales (26).
TABLA I CONDICIONES PARA LA EVALUACIÓN NANOTOXICOLÓGICA IN VITRO | |
Condición | Características |
Dosis inoculada y dosis celular | La dosis inoculada es variable y es por ello que se debe considerar también, efecto de dosis-respuesta, la dosis intracelular así como la densidad celular. |
La dosis celular inoculada no es siempre lo más relevante | La dosis de NPs que se inoculan a las células no es tan importante, lo que si se bene considerar es la dosis intracelular por la incorporación de las NPs a las células. |
¿Dispersas o no? | La mayoría de las investigaciones toman precaución en tratar de inocular las NPs dispersas con ayuda de agentes químicos o por agitación ultrasónica, sin embargo de las NPs son de naturaleza agregada en el aire, agua o alimentos, por lo cual se consideran menos citotóxicas. Los agentes químicos y la agitación usados para evitar la agregación de las NPs en ocasiones pueden producir resultados diferentes. Además, se ha demostrado que cuando se inoculación las NPs en el medio de cultivo, estás se agregan casi de forma instantánea. |
¿Qué unidad de medición se debe utilizar para expresar la dosis? | Existe mucha controversia respecto a la unidad de medición en que se debe expresar la dosis. La mayoría de las investigaciones representan mediante dosis gravimétricas (μg/mL de medio de cultivo, μg/cm2 del plato de cultivo, μg/106 células) y, en ocasiones, se utiliza la molaridad por ml de medio de cultivo (M/mL). Las concentraciones dependerán de la naturaleza de las NPs y si se encuentran suspendidas en un vehículo. |
Las células blanco a utilizar | Es de vital importancia tomar en cuenta el tipo de célula blanco a evaluar y la cantidad de divisiones celulares (PDL, de inglés population doubling level) que se han efectuado en las células a evaluar. |
Por lo antes mencionado, el presente artículo tiene como propósito analizar el
fueron recopilados de la base de datos elec- trónica PubMed y Science Direct, de acuer-
2
impacto biológico de las NPs de TiO
para
do con recomendaciones PRISMA para revi-
determinar su citotoxicidad, producción de ROS así como inducción de estrés oxidati- vo, a través de una revisión sistemática de
siones sistemáticas (27), durante el mes de octubre-noviembre de 2017. Se realizó una búsqueda de los métodos de síntesis de NPs
la bibliografía publicada hasta el momento
2
de TiO
con el fin de enriquecer el contenido
2
sobre la biocompatibilidad de éstas en con- tacto con células orales. Adicionalmente, se incluyó una breve sección que brinda un pa- norama general de los métodos de síntesis de NPs de TiO .
de la revisión, así como ofrecer un contexto adecuado del tema. La búsqueda electrónica se realizó en dichas bases de datos con las siguientes palabras clave y términos MeSH: viability AND oral cells AND titanium dioxi- de nanoparticles; Cytotoxicity AND titanium dioxide nanoparticles AND oral cells; Prosta-
2
glandin E
AND titanium dioxide nanoparti-
2
En la presente revisión sistemática, los datos disponibles sobre las NPs de TiO
cles AND oral cells; Oral cells AND oxidative stress AND titanium dioxide nanoparticles;
Reactive oxygen species generation AND ti- tanium dioxide nanoparticles AND oral cells.
Para refinar aún más la búsqueda, se to- maron los siguientes criterios de inclusión: Artículos de texto completo en idioma inglés centrados en el objetivo de esta revisión, que son los aquellos estudios originales publica- dos en revistas sobre biocompatibilidad de las
Las referencias bibliográficas de los artículos consultados también se consideraron como búsqueda manual, como artículos pertinen- tes no incluidos en la búsqueda electrónica si contaban con los criterios de inclusión de la búsqueda. La extracción de datos, la reco- lección, manejo y análisis de datos consistió en la descripción de la evidencia relevante,
2
NPs de TiO
en contacto con células orales.
la cual se presenta en diagrama de flujo de
La evaluación de la calidad de los artículos fue determinada por la investigación original y metodológicamente coherente y publicada en revistas indizadas de revisión por pares.
acuerdo a PRISMA (Fig. 1). Además, se pre- senta una evaluación crítica de los resultados de forma ordenada bajo encabezados apropia- dos para cada uno de ellos.
Fig. 1. Diagrama de flujo PRISMA de la revisión sistemática.
2
2
Uno de los aspectos importantes que se debe de considerar cuando se pretende utilizar un material estructurado es el méto- do de síntesis, ya que este va encaminado a controlar la morfología, tamaño y el ambien- te químico en la superficie de la NPs. En la literatura, desde hace más de dos décadas, existen reportes de síntesis de TiO , enfo- cados a la preparación de polvos, cristales, películas delgadas y estructuras. Existe una gran gama de métodos de síntesis que pue- den ser utilizados para obtener NPs de TiO ; desde los físicos hasta los biológicos, por lo que dependiendo de la aplicación final, será el método utilizado para elaborarlas (28).
Cuando se desea tener un buen control de la estequiometría, el tamaño y la forma los métodos más utilizados son los métodos químicos, entre los que podemos mencionar sol-gel, micro-emulsión, hidrotermal o depo- sición química de vapor. Sin embargo, estos métodos presentan algunas desventajas tales como el uso de precursores caros, tiempos largos de síntesis y, en algunos casos, presen- cia de impurezas.
El método de sol-gel, es en base húme- da; en la que se realiza una reacción de hi- drólisis del alcóxido o haluro del metal pre- cursor, dando paso a la condensación de la fase inorgánica; siendo uno de los más uti- lizados. Uno de los grupos de investigación que estudiaron algunas de las variables que interviene en este proceso es el de Sugimoto y col. (29–33); ellos variaron la relación del precursor con un grupo amino, pH, tempera- tura y tiempo de reacción y encontraron que controlando estas variables podían obtener NPs con diferentes morfologías y tamaños.
2
utilizaron etanol absoluto para llevar a cabo la hidrólisis y una membrana de celofán para aumentar el proceso de difusión, reportando NPs de TiO con alta pureza y tamaños de 15-60nm.
2
2
2
Otro de los métodos, en el cual utiliza agua como solvente es el de micro-emulsión donde se forman micelas para controlar el tamaño y la morfología de las NPs de TiO (36–42). En este método las variables que se deben de controlar son la solubilización, tensión superficial, conductividad y difusión. Kim y cols. (36) sintetizaron NPs de TiO , en agua y en amoniaco y obtuvieron partículas amorfas con tamaños de 10-20nm; al calci- nar a 600°C obtuvieron la fase anatasa y a 900°C la fase rutilo. Li y col. (40) utilizaron una fase oleosa y un surfactante no iónico y obtuvieron NPs amorfas; la fase anatasa se obtuvo utilizando rangos de temperatura de 200-750°C y la fase rutilo con una tempera- tura mayor a 750°C. Zhang y col. (11) sin- tetizaron TiO cristalino, utilizando ácidos y temperatura ambiente; su aporte principal fue la relación de la acidez con la relación de cristalinidad de la nanopartícula.
2
También, diferentes grupos de investi- gación (16–23), han sintetizado NPs de TiO utilizando método hidrotermal o solvoter- mal. Nian y col. (23) prepararon barras de anatasa en ausencia de surfactantes contro- lando el pH de la reacción.
2
En definitiva, se han reportado una gran variedad de métodos de síntesis para fabricación de NPs de TiO con diferentes morfologías y tamaños. De ellos, el método de sol-gel es el más recomendado para sinte- tizar nanopartículas monodispersas, que es un factor importante para obtener los bene- ficios de los materiales a escala nanométri- ca y que dichas NPs puedan ser utilizadas en aplicaciones biológicas.
Es importante mencionar que se debe
2
Su y col. (34), sintetizaron NPs de TiO
a par-
hacer un estudio detallado de la toxicidad
tir de la hidrólisis de n-Butóxido de Titanio
(IV) en isopropanol con un tamaño variable de 4-35nm con morfologías elipsoidales y po- lígonales. Wetchakun y Phanichphant (35),
2
y la biocompatibilidad de estas NPs, ya que en la literatura se muestra principalmente los estudios enfocados a las aplicaciones de TiO . En lo que se refiere a su biocompati-
bilidad, se han realizado trabajos de investi-
el dopaje con nitrógeno dio como resultado
gación acerca de la citotoxicidad de las NPs
2
la formación de TiO
principalmente en fase
2
de TiO
sobre diversas células de animales y
2
rutilo, mientras que el TiO
sin dopar fue
de humanos, e incluso es probable que sea uno de los nanomateriales más estudiados; sin embargo, existen pocos reportes acerca
principalmente anatasa. Se registró la acti- vidad mitocondrial de las células epiteliales gingivales humanas primarias (hGEPs), en
de la biocompatilibidad en células orales.
2
contacto con NPs de TiO
con y sin ser do-
Al llevar a cabo la revisión sistemática, uno de los aspectos que se observan en los estudios publicados hasta el momento es la imposibilidad de realizar una comparación cuantitativa debido a la gran variabilidad en las condiciones entre los diversos estudios.
padas con nitrógeno, con o sin luz azul (485 nm de longitud de onda) usando WST-1 (41). Además, realizaron un ensayo de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelular, el cual mostró que las partículas causaban una respuesta de estrés en hGEPs cuando se ex- ponían a 1 hora de luz azul, aunque esto no dio como resultado una liberación detecta- ble de citoquinas. Los resultados muestran
Así, se emplean diversos métodos de síntesis
2
que las NPs de TiO
dopado con nitrógeno
que generan diferentes tamaños de partícula y de morfología, las dosis de las NPs difieren entre sí, así como el número de subdivisiones
tienen actividad antibacteriana cuando se exponen a la luz azul y son biocompatibles a estas concentraciones. El tratamiento con
celulares de la población, el tipo de células,
2
NPs de TiO
dopadas con nitrógeno expues-
ya sea obtenidas a través explantes de teji- do o adquiridas como células inmortalizadas ATCC y los cultivos celulares primarios em- pleadas en los experimentos. Debido a esto, la siguiente revisión sistemática está enfoca- da en un análisis cualitativo de los datos pu- blicados en la literatura hasta el momento.
En las investigaciones que han sido pu- blicadas sobre la citotoxicidad de las NPs de
tas a luz ambiental resultó en un aumento ligero, aunque no significativo, de la prolife- ración celular. Además, el metabolismo celu- lar fue significativamente elevado en las cé- lulas expuestas a 50 y 100 μg/mL durante 24 horas, independientemente del tratamiento con luz. Al parecer, dichas NPs estimularon el metabolismo celular a concentraciones bajas e intermedias, pero no fueron citotóxi-
2
TiO
en contacto con células orales (vea Ta-
cas en ninguna concentración probada. De-
bla II), la viabilidad celular se ha evaluado por dos métodos, el ensayo de bromuro de
bido a resultados de investigaciones como las señaladas anteriormente, acerca de las
3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol
2
NPs y tubos de TiO
y de otras llevadas a cabo
(MTT) y el tetrazolio soluble en agua (WST- 1). Ambos métodos son muy eficientes e igualmente válidos para terminar la citotoxi- dad de un material; sin embargo, el WST-1 es una prueba más sensible capaz de detectar actividad celular aun cuando el conteo es es- caso.
con otras líneas celulares no provenientes de la cavidad oral, se considera por varios gru- pos de investigación, como un agente que potencialmente puede estimular la prolifera- ción celular por lo que se ha propuesto como recubrimiento para implantes dentales, sin embargo aunque la adición de NPs de TiO
En un estudio, en el cual se emplearon
2
ha mejorado la frecuencia de éxito de los
2
NPs de TiO
dopadas y sin dopar con nitró-
implantes en experimentos in vivo, todavía
geno a través del método del sol-gel, se ob- servaron agregados de partículas entre 100 a 300 nm, conformados por NPs primarias de 20-30 nm, en ambos casos. En el análisis de Difracción de Rayos X (DRX), se observó que
dicha tasa de éxito no es completamente sa- tisfactoria (42).
De igual manera, en otro estudio se uti- lizaron células epiteliales bucales humanas (TR146), las células se pusieron en contac-
Referencia | Fase cristalina | Morfología | Tamaño de partícula | Concentraciones probadas | Línea celular/ Tejido | Prueba/ Evaluación | Viabilidad celular |
(41) | Rutilo | Cuasi-esférica | 21,8±9,6 nm en agregados (≤300nm) | 50-200 μg/mL | hGEPs | WST-1 | En todas las concentraciones ≥100%. |
(42) | Mezcla de rutilo y anatasa | Film | Grosor de 380nm | NA | Tejido circundante al implante dental | Tinción azul de toluidina (en cortes histológicos) | No se observa muerte celular ni zonas inflamatorias |
(43) | Rutilo | Esférica | 1819±61,56nm | 50-200μg/mL | Células TR146 | MTS | En todas las concentraciones ≥100%. |
(44) | Anatasa | Esférica | ˂25nm | 0,05-3nM | HGF | MTT | En todas las concentraciones ≥100%. |
(45) | Mezcla de anatasa: rutilo 80:20 | Cuasi-esférica | 1)28,5 ± 9,8 nm y, 2)183,2 ± 73,9 nm | 0,031-0,25% w/v. | H376 | MTT | |
(46) | ND | Nanotubular | Diámetro de 120±15nm | Film sobre placas de titanio | HGF | MTT | En todas las concentraciones ≥100%. |
(47) | ND | Nanotubular | 588,85±3,92 | Film sobre placas de titanio | HGF | MTT | ≥100%. |
(48) | Mezcla de anatasa: rutilo 80:20. | Cuasi-esférica | 29,8 nm | 1pg/L -1g/L | HBEC | Tinción celular de yoduro de propidio | En todas las concentraciones probadas fue ≥75%. |
(49) | Anatasa | Esférica | ˂25nm | 0,05-3,2 mM | HSC-2 | MTT | 100±5% |
(50) | Anatasa | Esférica | ˂25nm | GIC + TiO (3% y 5%, w/w) | HPC, HGF, HPLF, HSC-2, HSC-3, HSC-4 y Ca9-22 | MTT | La incorporación de TiO al 3% disminuye la citotoxicidad de GIC, mientras que al 5% ésta aumenta notoriamente. |
(51) | ND | ND | ND | MTA+TiO (1%w/w) 2 | HGF | MTT | ≥100% |
(53) | Anatasa | Esférica | ˂25nm | 0,8-3,2mM | HGF | MTT | 100±5% |
(55) | 1)Pigmento anatasa, 2)NPs anatasa, 3)NPs anatasa 80% y rutilo 20% | Cuasi-esférica | 34±15nm 28±8nm 36±10nm | 50-200 μg/mL | HBEC | MTS | En todas las concentraciones probadas fue 100±5% |
2
CUADRO COMPARATIVO DE LOS ESTUDIOS DE LA TOXICIDAD DE TIO
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Biocompatibilidad y nanotoxicología de dióxido de titanio
SOBRE CÉLULAS DE LA CAVIDAD ORAL
2
359
Vol. 59(4): 352 - 368, 2018
NA= No aplica. ND= Dato no disponible. hGEPs= Células epiteliales gingivales humanas TR146= Carcinoma de células escamosas humanas. HGF= Fibro- blastos gingivales humanos. H376= Células epiteliales orales no queratinizadas. HBEC= Células epiteliales bucales humanas. HSC (-2,-3,-4)= Carcinoma oral de células escamosas. Ca9-22=células de carcinoma gingival. HPC= células pulpares humanas. HPLF= Células del ligamento periodontal humanas. GIC= cementos de ionómero de vidrio. MTA= Agregado de trióxido mineral. w=peso. v=volumen.
to con dosis entre 1-200 μg/mL de NPs de
partículas, que pueden producir cambios en
2
TiO
hidrófobas-rutilo (tamaño promedio de
las funciones mitocondriales que son segui-
20 nm, recubiertas con dimeticona) y NPs
dos por alteraciones celulares que desenca-
2
de TiO
hidrófilas-rutilo (tamaño promedio
denan el inicio del proceso apoptótico.
20 nm, recubiertas con glicerol). En sus re- sultados indicaron que la actividad mitocon- drial de las células puestas en contacto con cada uno de los tipos de NPs fue mayor en comparación con el control celular. En este estudio se realizó una prueba de mutageni- cidad (ensayo de mutación del gen HPRT), y se encontró que ninguna de las NPs desenca- denó la mutación génica en las células epite- liales bucales. En dicho estudio, las NPs hi- drofílicas produjeron aglomerados de casi el
2
Por otra parte, se ha reportado que el contacto de NPs de TiO , a diferentes con- centraciones, con contacto fibroblastos gin- givales humanos [del inglés Human Gingival Fibroblast (HGF)], no mostraron citotoxici- dad. Además, se observó proliferación celu- lar a bajas concentraciones y una disminu- ción en el número de células viables a mayor concentración; es decir que sigue un patrón dosis-dependiente (44).
En un estudio en el que se utilizaron
doble de tamaño que las NPs hidrofóbicas de
2
NPs de TiO
en una mezcla de anatasa–rutilo
2
TiO
al ser suspendidas tanto en PBS como
(en relación 80:20, estabilizadas en solución
en saliva artificial. Una posible explicación
acuosa, Sigma-Aldrich) comparadas con mi-
para la aparente proliferación celular podría
2
cropartículas de TiO
2
se encontró que el TiO ,
ser que dicho incremento es detectado en el ensayo como consecuencia del aumento de la actividad metabólica mitocondrial, la cual podría implicar una situación de estrés celu- lar. Para aclarar este problema, se examinó el potencial de membrana mitocondrial, el cual es indispensable para mantener la fun- ción fisiológica de las células. Una pérdida en el potencial de membrana produce lo que
2
tanto nano como micrométrico, fue bien to- lerado por las células al emplear un modelo de células epiteliales orales no queratinizadas (H376) a concentraciones que van de 0,031% a 0,250% peso/volumen. En dicho estudio se observó, a través de la medición de la libe- ración de lactato deshidrogenasa (LDH), la disrupción de la membrana celular inducida por las NPs de TiO ; la liberación de LHD para
genera agotamiento de la energía y muerte
2
todas las concentraciones de TiO
tanto nano
celular. El colorante TMRM funciona como un sensor de potencial de membrana mito- condrial y se usó para evaluar los cambios temporales. El efecto desequilibrante del po- tencial de membrana mitocondrial fue más pronunciado para las partículas hidrofílicas que para las hidrofóbicas. Por tanto, un po- tencial de membrana reducido de las mito- condrias indica el primer signo de muerte
como micrométrico, fue menor al 25%. Esto indicaría que, en dicho porcentaje de células, se libera una enzima citosólica estable en eta- pas tempranas durante la necrosis y en eta- pas tardías durante la apoptosis (45). Esto se interpreta como una citotoxicidad ligera, sin encontrar diferencias en dicha toxicidad atri- buibles al tamaño de partícula.
En un estudio acerca de la citotoxici-
celular programada. La producción de es-
2
dad de nanotubos de TiO
(diámetro=120
pecies reactivas de oxígeno (ROS) se evaluó en ausencia de luz UV. Los datos revelaron que las partículas hidrófobas causaron una mayor producción de ROS en comparación con las células no tratadas. Sin embargo, la fluorescencia relativa obtenida fue marcada- mente menor que el control positivo (43). Esto puede interpretarse como que existe
nm) en HGF monitorizados por la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial (ensayo de MTT), después de un período de exposi- ción de 72 h, se observó un ligero aumento en el número de células metabólicamente activas (46), lo cual clínicamente se traduci- ría como proliferación celular.
Otro aspecto que es abordado es la posi-
una generación de ROS por parte de estas
2
bilidad de emplear nanotubos de TiO
como
reservorio de lenta liberación de factores de crecimiento tales como el Factor de creci- miento fibroblástico 2. En este estudio se muestra una citotoxicidad de los nanotubos
pura; en cambio, en DMEM/F-12 el tamaño fue un poco mayor que en aquellas partícu- las suspendidas en DMEM pero 28% más pe- queñas que las suspendidas en agua ultrapu-
2
de TiO
en forma de film sobre placas de Ti
ra. Los valores absolutos del potencial zeta
que podría ser empleado para fines prácticos como un recubrimiento para implantes. Al evaluar la viabilidad celular de los HGF se encontró una viabilidad ligeramente mayor que el control, la cual aumentaba aún más si
se desplazaron hacia potenciales negativos en los medios de cultivo, DMEM/F-12 (7,6 mV) y DMEM (-11,6 mV) en comparación con los valores del potencial zeta del agua ultrapura (+21,8 mV). Al ser suspendidas
se exponía a diferentes concentraciones del
2
en agua las NPs de TiO
con un tamaño
2
Factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2) de manera dosis dependiente, lo cual a su vez también incrementa la adhesión celular a las placas de Ti funcionalizadas con los na- notubos y el FGF2. En este estudio se remar- ca la importancia de continuar estudiando la posibilidad de emplear dicho NPs de TiO para liberación prolongada de factores de crecimiento de manera local, lo cual abriría la posibilidad de generar otras líneas de in- vestigación prometedoras (47).
Además, en consistencia con esta inves-
2
de 29,8 nm incrementó el tamaño a 392,2 nm en agua ultrapura cuyo pH fue de 6,8, DMEM/F-12 con un pH de 7,4 con 282 nm y DMEM completo (pH 7,4) con 260,9 nm, por lo que el medio es un factor determi- nante para la agregación de las partículas. Además, al parecer, existe una relación di- recta entre el pH del medio de cultivo, el potencial zeta y la aglomeración de las NPs; esto es un aspecto importante ya que de di- chas condiciones dependerá el tamaño final de los agregados de TiO . Al observar los re-
2
tigación, se probaron las NPs de TiO
(pure-
sultados de estudios sobre vialidad celular
za ≥ 99,5%; anatasa/rutilo = 80:20; y tama-
2
del contacto de las NPs de TiO
en cultivo
ño de partícula = 27 nm) a concentraciones desde 100 mg/L en diluciones seriadas hasta 1 pg/L frente a las células TR146. Las célu- las tratadas fueron igual de viables (más del 98% de viabilidad relativa) que el grupo con- trol no tratado. Dichas células tratadas son igual de viables (más del 98% de viabilidad relativa) que el grupo control no tratado. En
celular, éstas tienden a agregarse entre sí muy fácilmente al entrar en contacto con el medio de cultivo celular, formando aglome- rados de NPs (Fig. 2), que muestran menor toxicidad los aglomerados cuando de com- para con las NPs dispersas. Al parecer, la transición entre la agregación y dispersión de estas NPs produce resultados experimen-
2,
las células TR146 con NPs de TiO
la muer-
tales diferentes dependiendo la naturaleza
te celular significativa sólo se detectó a una dosis de 1 g/L con una disminución del 24% en la viabilidad celular relativa.
Otro aspecto de discusión en este estu-
de dichos experimentos. Dado los datos de los reportes anteriores, la citotoxicidad de dichas NPs se genera en función de la con- centración; por lo que mientras las concen-
2
dio, es cuando las NPs de TiO
están en sus-
traciones sean bajas, la citotoxicidad del
pensión en cuyo caso tienden a agregarse y el grado de agregación depende del disper- sante utilizado. Esto se demostró al compa- rar el tamaño hidrodinámico de las NPs sus- pendidas en agua ultrapura, DMEM/F-12 y únicamente DMEM. Los resultados mostra-
material es mínima. En el estudio referido se observó una baja citotoxicidad en TR146. En dichas células, la muerte celular sólo se detectó a una dosis de 1 g/L, con una dismi- nución del 24% en la viabilidad celular (48).
Por otra parte, es muy escasa la informa-
ron que el tamaño hidrodinámico de las NPs
2
ción sobre el efecto de las NPs de TiO
sobre
en DMEM fue 33-37% menor que el tamaño de las partículas suspendidas en agua ultra-
las células cancerígenas. Debido a que estas células exhiben una alta capacidad de proli-
Fig. 2. Imagen representativa de la ultra estructura de las nanopartículas (NPs) de dióxido de titanio
2
2
(TiO ). Las NPs de TiO
fueron disueltas en agua bidestilada y agitadas en ultrasonido durante 5
min antes de inocularse en el medio de cultivo. Una gota de medio de cultivo conteniendo las NPs
2
de TiO
fue colocada sobre un portamuestras de aluminio; el espécimen se dejó secar durante 48
hrs a temperatura ambiente. La muestra fue recubierta con una capa de oro de 50 nm. La topo-
2
grafía de las NPs de TiO
fue observada en microscopia electrónica de barrido (SEM, del inglés
2
Scanning electron microscope, JSM-6360LV; JEOL, Tachikawa, Japón) con electrones secundarios (x10,000 y 15 kV).Se observa una agregación de las nanopartículas (NPs) de dióxido de titanio (TiO ).
feración y, tomando en cuenta el comporta- miento reportado en células normales de las
2
centaje mayor de NPs de cualquier composi- ción (no necesariamente de TiO ) genera un
2
NPs de TiO
se podría suponer que tampoco
decremento de las propiedades físicas origi-
serian citotóxicas para las células cancerí- genas. Para demostrar esto, se pusieron en
nales del material. En este sentido, se realizó un estudio, en el cual se incorporaron NPs
2
contacto NPs de TiO
con células humanas
2
de TiO
(3 y 5%) en diferentes cementos de
de carcinoma escamoso [del inglés Human Squamous Carcinoma (HSC-2)], las cuales no mostraron citotoxicidad y al combinarse con agentes quimioterapéuticos tampoco se potencializó el efecto antitumoral de dichos fármacos [doxorubicina, melfalán, 5-fluorou- racilo (5-FU), gefitinib, y docetaxel] (49), sin mostrar diferencias estadísticamente
2
ionómero de vidrio (GIC, de 0 a 40 mg/mL). Se encontró una citotoxicidad moderada, independientemente de la composición del GIC y la presencia o la ausencia de NPs de TiO ; sin embargo, extrañamente, las células de cáncer orales fueron más sensibles que las células orales normales (50). También se realizó un estudio para evaluar la citotoxici-
significativas.
2
dad del MTA y MTA con NPs de TiO
al 1% en
Otra línea de estudios involucra la in-
peso durante 24 y 48 h después de ponerse
2
corporación de las NPs de TiO
a materiales
en contacto con HGF. Los resultados mos-
de uso odontológico en porcentajes menores al 5%, ya que dopar un material con un por-
traron un aumento en la viabilidad celular de ambos grupos, y en ambos intervalos de
tiempo, respecto al control de células sin inocular. Sin embargo, una de las deficien- cias que impiden la reproducibilidad de este
sa 1 y 2 al estar presente la IL -1β, agravando el efecto pro-inflamatorio (53). Esta informa- ción es de suma importancia, ya que la pre-
estudio, es que no se especifica el tamaño de
2
sencia de NPs de TiO
en cavidad bucal y ante
partícula ni el método de obtención de las nanopartículas (51).
Al realizar los ensayos de viabilidad ce- lular, una consideración importante es que el método del MTT o incluso el WST-1 pue- den dar resultados erróneos. El primero, por ejemplo, se basa en la reducción metabólica del MTT realizada por la enzima mitocon- drial succinato-deshidrogenasa en un com- puesto coloreado de color azul-violeta (for- mazán), permitiendo determinar la función mitocondrial de las células tratadas. En el empleo de este ensayo se pueden producir
una enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo en la periodontitis y gingivitis) agra- va significativamente la inflamación, pero al conocer los mecanismos pro-inflamatorios se puede contrarrestar dicha inflamación con antiinflamatorios no esteroideos.
Es imprescindible mencionar que la ac- ción pro-inflamatoria puede ser el resultado de la presencia de lipopolisacáridos (LPS) en las NPs; sin embargo, se ha eliminado esta posibilidad a través de la adición intencio- nal de LPS en el cultivo, concluyendo que su presencia (a una concentración de 0,2 mM
lecturas erróneas debido a que ciertas NPs
2
de NPs de TiO
con 9,0 ng de LPS) no es su-
reaccionan con los reactivos empleados en
ficiente para inducir una acción pro-inflama-
los ensayos de citotoxicidad al incorporar
2
toria, siendo las NPs de TiO
la causa directa
un solvente orgánico aprótico, comúnmente dimetil sulfóxido, lo que genera la interpre- tación de las partículas como células vivas o con actividad mitocondrial en el ensayo (52). Para evitar que esto ocurra debe tras-
de la inducción del efecto inflamatorio en cultivo de HGF (44, 52).
Se encontró un único estudio, realizado por nuestro grupo de trabajo, donde se reali- zó un análisis con técnica metabolómica de
portarse el sobrenadante de los platos de
2
las NPs de TiO
en HGF inducidas a un esta-
cultivo a una microplaca nueva antes de la lectura de la densidad óptica. Esto resuelve
2
do inflamatorio con IL-1β. Las NPs de TiO aumentaron significativamente la producción
el problema dando una lectura precisa de la
2
de prostaglandina E
inducida por IL-1β y ex-
cantidad de actividad metabólica que se en- tiende como el número de células viables en el cultivo.
presión de la proteína COX-1 y COX-2. IL-1β, redujo las concentraciones intracelulares de metabolitos primarios en general, especial- mente las vías sintéticas de los aminoácidos, el ciclo de urea, poliamina, S-adenosilmetio- na y glutatión (52), ciclos relacionados con el
2
A pesar de que las NPs de TiO
no mos-
proceso inflamatorio e incremento del estrés
traron citoxicidad en cultivo con HGF, estas NPs inducen a un incremento en la produc-
oxidativo. Por tal motivo, se recomendaría el uso cuidadoso de los materiales dentales que
2
ción de prostaglandina E
2
(PGE ) con la míni-
2
contienen NPs de TiO
en pacientes con en-
ma concentración de 0,2 mM (47), y en ma- yor grado cuando se adiciona interleucina-1β (IL -1β), un agente inflamatorio conocido y estudiado previamente por nuestro grupo de
fermedades pro-inflamatorias agudas o cró- nicas como gingivitis o periodontitis que son muy comunes en la cavidad oral.
2
investigación. El contacto de las NPs de TiO
con HGF, refleja una actividad pro-inflamato- ria cuyo mecanismo se ha identificado por el
2
La interacción de las NPs de TiO
con
incremento de la expresión de ciclooxigena-
las células es un tema de relevancia para
comprender los mecanismos de citotoxi- cidad de dicho material. En un estudio, se identificó que la incorporación de las NPs de
drial que es un elemento indispensable para la homeostasis celular (43).
A través de la revisión de la literatura es
2
TiO
a las células se lleva a cabo por medio
evidente que se han observado diferencias en
de endocitosis por vía de receptores tipo toll
2
la localización de NPs de TiO
en el interior
4 (TLR 4) (54). La observación con micros- copio electrónico de transmisión demostró
de las células. Esto puede deberse a diversos factores intrínsecos a la morfología, tamaño,
2
la incorporación de NPs de TiO
en forma de
método de síntesis y agente estabilizador de
endosoma temprano y la inducción de for- mación de vesículas lisosomales de las célu- las (55).
2
En células orales normales de HGF, HPLF y cancerígenas HSC-2 se ha observado la incorporación de las NPs de TiO . A pesar de la formación de agregados de NPs, algu- nas logran incorporarse a la célula y estas se depositan y coexisten como vesículas con organelos celulares donde las NPs son vacuo- lizadas para su eliminación. Esta atracción o
las NPs. Es indudable que el medio en el que dichas NPs son solubilizadas juega un papel importante en su interacción con las células dado el cambio producido en el potencial Z de la partícula y la formación de aglomerados.
En un futuro, es necesario contar con mayor evidencia científica para determinar la biocompatibilidad y la aplicación segura
incorporación dentro de las células puede ser
2
de las NPs de TiO
en contacto con las cé-
causa de la interacción entre los grupos ami- no y carboxilo de la membrana celular (con carga negativa) y la superficie de las NPs de
lulas orales. Para esto, el estudio de perfiles metabólicos será capaz de proporcionar in- formación sobre la toxicidad de las NPs de
2
TiO
(con carga positiva) (55). Sin embar-
2
TiO , los procesos patológicos asociados a
go, el mecanismo de incorporación de las
éstas y su influencia en las funciones bio-
2
NPs de TiO
a las células aún no se conoce
químicas. Los estudios metabolómicos han
2
ampliamente. Diversos estudios señalan que las NPs, después de incorporarse a la célula se posicionan como endosomas y se obsrva la atracción de lisosomas en el citoplasma (44, 53). En otro estudio con NPs de TiO de rutilo, hidrofílicas (20 nm) y de rutilo hi- drofóbicas (20 nm) se observaron diferencias significativas en la localización de partículas intracelulares en células epiteliales bucales humanas (TR146). Las partículas hidrofílicas se encontraron libremente distribuidas en el citoplasma, mientras que sus homólogas hidrófobas fueron engullidas en estructuras vesiculares; por lo tanto, los efectos secunda- rios citóxicos fueron bajos ya que las partícu- las aisladas del citoplasma no reaccionan con las estructuras intracelulares. Al parecer, las partículas hidrófobas no se unieron a las ve- sículas; en consecuencia, pudieron interferir con la membrana mitocondrial externa, al-
sido ampliamente utilizados en la evaluación de la seguridad de los productos químicos como un método para identificar nanotoxi- cidad en los órganos blancos y el mecanis- mo toxicológico a través de biomarcadores de orina y suero. Una técnica metabolómica selectiva es la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), acoplado con el patrón de reconocimiento (PR). Las investi- gaciones futuras podrían emplear dichos mé- todos, ya que éstos pueden ofrecer informa- ción nanotoxicológica rápida y no invasiva, sólida y reproducible (56). De esta manera, mediante pruebas de expresión metabólica es necesario determinar las vías inflamato- rias de señalización y el mecanismo de inte- racción de los metabolitos, así como crear estrategias terapéuticas específicas para la aplicación de antiinflamatorios como mé- todo de prevención y determinar los efectos
terando el potencial de membrana mitocon-
2
dosis-respuesta de las NPs de TiO
en diver-
sos intervalos de tiempo, particularmente en estudios in vivo. La demostración de la bio-
2
seguridad en el uso de las NPs de TiO
deben
Proyecto UNAM-DGAPA, PAPIME:
estar encaminadas a probar su biocompatibi- lidad en modelos animales.
Se concluye que los trabajos de investi- gación encaminados al estudio de la interac-
PE201617 y PAPIIT: IA204516. Red Farmo-
químicos, CONACyT.
2
ción de las NPs de TiO
con células y tejidos
bucales es limitada debido a que este tipo de materiales se usaban en otras áreas de apli- cación, como fotocalizadores o portadores de carga por mencionar algunos. Las publi- caciones están orientados a pruebas de cito- toxicidad en otro tipo de células somáticas (no provenientes de la cavidad oral) y órganos que pueden ser afectados durante los méto- dos de síntesis o manipulación de la NPs. Por lo anterior, es de suma importancia revisar los resultados con los que se cuenta hasta el momento, ya que uno de los temas científicos de gran relevancia es la creación de biomate- riales odontológicos basados en NPs.
2
2
La evidencia con la que se cuenta hasta el momento sugiere que las NPs de TiO en cultivos de células de la cavidad oral no pro- ducen un efecto citotóxico y al parecer esti- mulan el crecimiento celular a bajas concen- traciones (hormesis). Este comportamiento puede ser atribuido a la aglomeración de las NPs al entrar en contacto con el cultivo ce- lular. De manera general, en los resultados de los estudios en células in vitro se observa cierto grado de biocompatibilidad, siendo un paso importante en el campo científico encaminado al uso de las NPs de TiO en odontología que debe se ser extrapolado a un sistema in vivo tomado un cuenta todas las condiciones inherentes para realizar es- tos estudios.
Por otro lado, la investigación clínica sugiere que un efecto pro-inflamatorio en fibroblastos gingivales humanos es ocasio-
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2242–2250.
noparticles. Curr Drug Targets 2011; 12:
2
nado por el uso de NPs de TiO
en ausencia
357–365.
de interleucina-1β;y podría agravarse en pa-
cientes con enfermedades bucales inflama- torias crónicas.
761–769.
2
372–380.
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