Invest Clin 59(4): 302 - 317, 2018 https://doi.org/10.22209/IC.v59n4a02
Evaluación de la expresión de ARNm de genes virales E2, E6 y E7 como marcadores predictivos de progresión en lesiones producidas por VPH 16.
Angel Mauricio Vitriago-Rendón1, Marwan Said Aguilar-Mejía2, Pedro José Michelli-Gago2, Joseba Celaya Linaza2 y Cristina Gutiérrez3
Banco Municipal de Sangre del Distrito Capital. Caracas, Venezuela.
Laboratorio de Patología Molecular, Cátedra de Anatomía Patológica, Escuela Luis Razzetti, Facultad de Medicina, UCV. Caracas, Venezuela.
Cátedra de Virología, Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, UCV. Caracas. Venezuela.
Resumen. El Virus del Papiloma Humano (VPH) pertenece a un grupo de virus con ADN de doble cadena, con 35 genotipos capaces de infectar el epitelio de superficies cutáneas en todo el cuerpo y mucosas del área ano-genital. El ge- notipo 16 es clasificado como un VPH de alto riesgo oncogénico y ha sido iden- tificado con más frecuencia en infecciones y carcinomas cérvico-uterinos. El objetivo planteado en este trabajo fue evaluar la expresión de los ARNm virales como indicadores de progresión de las lesiones intraepiteliales (LIE), causadas por VPH 16. Se procedió a la determinación y cuantificación de los ARNm de los genes virales E2, E6 y E7 mediante el uso de una prueba de reacción en cadena polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). El VPH 16 se detectó en un 31,58% (12/38) del total de pacientes; en las lesiones de bajo grado se observó en un 29,63% y en las de alto grado, en un 36,36% de los casos. El total de ARNm viral cuantificado aumentó al incrementarse la can- tidad de VPH oncogénicos presentes en la muestra (R2= 0,51). Se encontró una correlación (R2= 0,36), entre la expresión del ARNm del Gen E7 y la progresión del grado de la lesión. Se llegó a la conclusión que, la expresión de ARNm de los genes virales E6 y E7 pudieran ser utilizados en el futuro para la evaluación efectiva de la progresión en las lesiones de pacientes infectados por VPH 16 para así lograr la diferenciación de las lesiones pre-cancerosas.
Evaluation of viral genes E2, E6 and E7 mRNA expression as predictive markers of progression of lesions caused by HPV16.
Invest Clin 2018; 59 (4): 302 - 317
Abstract. The human papilloma virus (HPV) belongs to a group of viruses with double-stranded DNA, with 35 genotypes capable of infecting the epithe- lium of skin surfaces through the body and mucous membranes of the ano-gen- ital area. Genotype 16 is classified as a high-risk oncogenic HPV and has been identified more frequently in cervical-uterine infections and carcinomas. The objective proposed in this work was to evaluate the expression of viral mRNAs as indicators of progression of intraepithelial lesions (IEL), caused by HPV 16. We proceeded to the determination of the mRNA of the viral genes E2, E6, and E7 through the use of a polymerase chain reaction test with quantitative real time reverse transcriptase (RT-qPCR). HPV 16 was detected in 31.58% (12/38) of the total of patients; in low-grade lesions it was observed in 29.63% and in high- grade lesions, in 36.36% of the cases. The total quantified viral mRNA increased as the amount of oncogenic HPV present in the sample increased (R2= 0.51). A correlation (R2= 0.36) was found between the expression of the E7gene and the progression of the degree of the lesion. It was concluded that, the expression of mRNA of the viral genes E6 and E7 could be used in the future for the effective evaluation of the progression in the lesions of patients infected by HPV 16 in order to achieve the differentiation of the pre-cancerous lesions.
Recibido 04-09-2017 Aceptado 20-11-2018
El Virus Papiloma Humano (VPH) es un virus ADN de doble cadena perteneciente a la familia Papillomaviridae, que afecta de for- ma característica al epitelio de piel y muco- sas, ya que su proceso de replicación causa alteraciones celulares de tipo proliferativo. Según el grado de atipia histológica de la le- sión, estas alteraciones se categorizan como lesiones de bajo grado (Condilomas) o lesio- nes de alto grado con desarrollo de neopla- sias intraepiteliales que pueden evolucionar hasta Carcinoma in situ e invasivo.
Desde el punto de vista molecular, el VPH se divide en más de 100 genotipos, con unos 35 de localización ano-genital. Según el riesgo a sufrir transformación maligna,
se clasifican como VPH de bajo o alto ries- go oncogénico. El VPH posee en su genoma ocho genes, de los cuales E6 y E7 codifican, en genotipos de alto riesgo, oncoproteínas con efectos a nivel de la división celular y la respuesta inmune, que con el tiempo son los causantes del desarrollo del cáncer uterino, una patología de elevada morbilidad y mor- talidad en Venezuela y en el mundo (1, 2).
Recientes investigaciones han demos- trado que el incremento de la carga viral se relaciona de manera directa con un aumen- to del crecimiento de las neoplasias; de igual forma se han demostrado relaciones simila- res entre la presencia y la cuantificación de los genes (1,3-5); cuando el VPH intracelular está fuera de los cromosomas, la expresión de los genes virales, también es responsable de
los cambios que ocurren en la célula, para la producción de viriones infectantes. Además, se ha determinado que la proteína viral E2 está encargada de regular la producción de las oncoproteínas virales E6 y E7 que actúan sobre el ciclo celular; sin embargo, cuando el virus se integra al genoma celular, el gen de E2 queda excluido de la integración, por lo tanto, al perderse la regulación de esta for- ma, el crecimiento celular es incontrolado (6). De estos hallazgos, surge el interés de la evaluación conjunta de los ácidos ribonu- cleicos mensajeros (ARNm) de las oncopro- teínas E7, E6 y de la proteína E2, debido a la relación existente entre ellos y la evolución neoplásica, la cual podría permitir el análisis del avance de las lesiones causadas por VPH de alto riesgo (6).
Investigaciones realizadas en México reportaron que las infecciones por VPH de bajo riesgo, no tienen posibilidades de oca- sionar cáncer de cuello uterino, pero si estas son producidas por un VPH de alto riesgo, las posibilidades aumentan significativamen- te; por lo tanto, la técnica de biología mo- lecular, conocida como Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es muy importante ya que permite la detección y genotipifica- ción viral del VPH genital causante de la in- fección (7).
En la actualidad, el diagnóstico cérvico- uterino de VPH, se realiza con la prueba de despistaje citológico microscópico de Papa- nicolaou (Pap) y la prueba de detección mo- lecular del ADN del VPH por PCR. La prueba de VPH ADN es la única aprobada por la FDA (Administración de Drogas y Alimentos) de los Estados Unidos de América (8) y la Prue- ba Pap a pesar de ser una gran herramienta de cribado para la detección de lesiones pre- cancerosas y cancerosas, no detecta al virus del VPH, sino los cambios citológicos pro- ducidos por la infección lítica (coilocitosis caracterizada por presencia de un halo claro citoplasmático) o lisogénica (agrandamien- to e hipercromatismo nuclear con pérdida de la relación núcleo-citoplasma normal) del virus; su metodología es dependiente de la
evaluación subjetiva, lo cual es una gran li- mitación, ya que no está relacionada direc- tamente con el virus (5, 9).
En Venezuela la infección genital por VPH afecta comúnmente a parejas, obser- vándose que un 70% de las personas lo ha adquirido por transmisión sexual. El hecho de que el hombre infectado puede no pre- sentar ninguna sintomatología llamativa (solo el 40% presenta síntomas), favorece la transmisión de la enfermedad sin el conoci- miento de presentarla (10). En consecuen- cia, el VPH se convierte en un problema de salud pública ya que el 80% de la población portadora del virus no es consciente de su infección (10).
En una recopilación estadística realizada en Venezuela durante los años 2007 a 2011, se encontró que cada año fueron diagnostica- dos 3.685 casos de cáncer del cuello uterino, el cual representó un 57% de la incidencia del cáncer en el sexo femenino; en la misma reco- pilación, reportaron un total de 1.602 muer- tes a causa del cáncer de cuello uterino (11), lo cual se mantuvo al año siguiente, siendo reportadas 1.321 muertes en el anuario de mortalidad del año 2012 en Venezuela (2).
En el año 2001 se encontró que en Ve- nezuela, como en otras partes del mundo, el genotipo relacionado con mayor frecuencia con lesiones ano-genitales pre-malignas y malignas, es el VPH-16 (10), el cual posee reconocidas propiedades oncogénicas; en esa misma investigación concluyeron que adicional a los criterios citológicos, histopa- tológicos y colposcópicos utilizados usual- mente para el diagnóstico de la infección, se deberían realizar técnicas de biología mole- cular para la detección del virus.
Se ha demostrado en diversas inves- tigaciones, que los pacientes que padecen carcinoma de células escamosas presentan una carga viral del VPH alta junto a una ex- presión positiva de los ARNm (ARN mensa- jeros) de las oncoproteínas E6 y E7; por el contrario, pacientes que tienen un mejor pronóstico son los que presentan una carga viral (ADN viral positivo) con ausencia del
ARNm, ya que es indicativo que el proceso de la oncogénesis no está ocurriendo activa- mente (12).
Con base en lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar la expresión de los ARNm de genes virales como marcadores predictivos del avance de las lesiones produ- cidas por VPH 16, mediante el uso de la téc- nica de biología molecular conocida como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), para lograr de esta forma, acelerar el diagnóstico oportuno de las lesiones pre- cancerosas, para que los pacientes reciban el tratamiento de manera precoz y así dis- minuir la progresión de las lesiones por este genotipo de virus (12).
En la presente investigación fueron utilizadas muestras preservadas en el Labo- ratorio de Patología Molecular, Cátedra de Anatomía Patológica, Instituto Anatomopa- tológico José Antonio O’Daly, Escuela Luis Razetti, Facultad de Medicina de la Univer- sidad Central de Venezuela (UCV), Caracas, Venezuela; una población total de 38 pa- cientes, provenientes de diversos lugares del país, 23 de sexo femenino y 15 masculinos, todos mayores de 18 años con diagnóstico anatomopatológico (citológico e histológi- co) de VPH en conjunto con la presencia de lesiones epiteliales descritas según los esta- tutos del Sistema Bethesda (13). Este traba- jo fue avalado por el Comité de Bioética de la Escuela de Bioanálisis de la UCV (CBEB).
Para la toma de muestra, a cada pa- ciente le fue entregada la planilla de consen- timiento informado previa explicación de la misma; adicionalmente, fue completada una planilla con la información relevante del pa- ciente y las características de la lesión pre- sente. La toma fue realizada por el médico tratante; en las mujeres por medio de un ce- pillado del cuello uterino y en los hombres por un raspado anal o peneal según la ubi-
cación de la infección. La muestra fue colo- cada en un medio de transporte y llevada en un breve lapso de tiempo al Laboratorio de Patología Molecular; las biopsias, fijadas con Formaldehído al 10% fueron embebidas en un bloque de parafina para posteriormente realizar la coloración de Papanicolaou y una porción de cada muestra fue preservada a
-70°C para su posterior uso en Biología Mo- lecular.
Para cada procedimiento en el laborato- rio, se esterilizó la Campana de Bioseguridad Clase II (Promega) por medio de luz ultravio- leta durante 15 minutos; posteriormente, los reactivos conservados a -20°C, fueron equili- brados a temperatura ambiente, protegidos de la luz solar directa y colocados en hielo para así mantener su estabilidad, de igual for- ma se hizo con las muestras, las cuales se en- contraban conservadas a -70°C.
El contenido del medio de transporte fue transferido a un tubo de 1,5 mL, el cepillo fue escurrido al máximo, siendo el escurrido agregado al tubo. La extracción del material genético fue realizada con el estuche QIAmp DNA kit N° 51306 (QIAGEN) según el proce- dimiento descrito por el fabricante, todas las centrifugaciones fueron realizadas a 17.900 g, en una micro centrífuga Spectrafuge 24D de Labnet International. Finalizado el proce- so las muestras fueron conservadas a -70°C hasta su procesamiento (14).
El proceso de genotipificación consistió en una PCR multiplex anidada en dos pasos; en el primer paso se realizó una ampliación utilizando cebadores de consenso GP5+/ GP6+ y MY09/MY11 que reconocen secuen- cias comunes del Gen L1 en todos los VPH,
esto permite la detección del genoma viral en la muestra (15, 16). Posteriormente se realizó la tipificación, consistente en una PCR multiplex anidada de 2 rondas progra- madas en un termociclador convencional TC-3000X. En la primera ronda se amplificó la región E6/E7, facilitando y mejorando los resultados en la segunda ronda, en la cual se utilizaron varios conjuntos de cebadores permitiendo la tipificación de 19 genotipos. Esta metodología no solo logra determinar el genotipo de VPH presente, también per- mite detectar infecciones por múltiples ge- notipos de VPH (coinfección) (15-17).
Los patrones de amplicones de los ge- nes E7, E6 y E2 del VPH se obtuvieron a par- tir de las muestras con VPH 16. La mezcla maestra de todas las PCR convencionales fue preparada bajo condiciones establecidas por el protocolo del estuche de Go Taq® qPCR Systems N° A6001 (Promega).
La amplificación de la secuencia espe- cífica del gen E7 del VPH 16 se realizó por medio de la PCR convencional utilizando la pareja de cebadores y la programación estan- darizados para el termociclador TC-3000X en (1, 16, 17). En la amplificación de la se- cuencia específica del gen E6 del VPH 16, la pareja de cebadores utilizados y la progra- mación del termociclador TC-3000X se rea- lizó en base a trabajos consultados (15-17).
En la amplificación de la sección espe- cífica del gen E2 del VPH 16 la pareja de ce- badores y la programación del termociclador TC-3000X fueron los mismos que el trabajo consultado de (16).
La comprobación de la amplificación fue realizada con un gel de Agarosa prepa- rado al 2% con un buffer TAE al 0,5%. El equipo utilizado para la corrida electrofo- rética fue el Gel Electrofores Systemmini- RunGE-100 BIOLR Technology COLIO, se usaron 8 µL de muestra más 3 µL de mar- cador. Para la visualización de las bandas de
amplificación, se agregó Bromuro de Etidio (10 mg/mL) al gel de Agarosa (2µL) duran- te su preparación lo que facilitó la observa- ción de los productos con el Transilumina- dor de luz ultravioleta (Uvitec). Las bandas esperadas para cada producto fueron las siguientes: VPH 16 E7: 115 pares de bases (pb); VPH 16 E6: 134 pb; VPH 16 E2: 149
pb; GAPDH: 230 pb, con cada electroforesis se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb (Promega) (1,15).
Cada patrón fue purificado por separado para la eliminación de elementos y contami- nantes según las instrucciones establecidas por el fabricante del estuche de Purificación de PCR (QIAquick® PCR Purification Kit) N° 28104.
La medición de la concentración de los patrones fue realizada con el uso de un Espectrofotómetro NAS-99, por medio del cociente (260/280) se obtuvo un valor que permitió conocer si el filtrado presentaba proteínas o material degradado, los filtra- dos con cocientes (260/280) > 2 fueron aceptados y los filtrados con un cociente (260/280) ≤ 1,9 fueron descartados (14). La medición de cada patrón se realizó por triplicado para la obtención de un valor promediado, el cálculo de la concentración del ADN se realizó con la fórmula: donde la concentración (ng/µL) es dividida entre el producto de la longitud del producto (pb) y el número de gramos de ADN de doble ca- dena presentes en un mol, todo multiplica- do por el número de Avogadro, esta fórmu- la permitió convertir la concentración de cada patrón de (g/µL) a (#de moléculas/
µL) (18).
Fueron realizadas diluciones seriadas 1/10 del patrón de cada gen; se inició con
109 #moléculas/µL hasta 102 #moléculas/
µL, las diluciones fueron realizadas en tubos de 1,5 mL con agua destilada libre de nu- cleasas, se identificaron y separaron en alí- cuotas y fueron almacenadas a -70°C.
La mezcla maestra para la q-PCR (en tiempo real) se preparó en base al protocolo propuesto por el fabricante del estuche Go Taq® qPCR Systems N° A6001 (Promega), quedando los reactivos en el volumen final (25 µL) en las siguientes concentraciones:
un paso se realizó en el Termociclador en tiempo real 7500 de Applied Biosystems; la mezcla de reactivos se realizó según las instrucciones del fabricante del estuche Gotaq® 1-Step RT-qPCR Systems N° A6020 (Promega), quedando las concentraciones: Gotaq®qPCR Master Mix (1x), GoScript™ RT Mix for 1-Step RT-qPCR, (0,4 µL), agua libre
2
Buffer 1x, MgCl
3 mM, SYBR-Green 0,1x,
de Nucleasas (1,6 µL), cebadores (1,25 mM
ROX 0,3x, dNTPs 0,25 mM, cebadores 0,2 mM cada uno (esta pareja de cebadores va- rió según la secuencia a amplificar), Taq Po- limerasa 0,05 uL, templado (ADN) (2µL). Para lograr la cuantificación de los ARNm se realizaron curvas de calibración para cada gen, para lo cual se utilizaron los patrones de amplicones obtenidos en el laboratorio, a los cuales se les conocía su concentración en número (#) de moléculas/µL.
Cada curva de calibración fue progra- mada en el Termociclador en tiempo real 7500 de Applied Biosystems en una misma placa; se programaron los tiempos y tempe- raturas estandarizadas durante la obtención de los patrones de los genes de E7, E6 y E2: Desnaturalización 95°C x 15min; 40 Ciclos 95°C x 45s, 55°C x 60s, 72°Cx 45s; Curva de Disociación 60-95°C en un período continuo.
La extracción del ARN de las muestras fue realizada según lo establecido por el fa- bricante del estuche de Extracción de ARN viral (QIAquick® Viral RNA Kit) N° 52906 Qiagen. Todas las centrifugaciones fueron realizadas a 6.000g en la micro centrífuga Spectrafuge 24D. Al finalizar, el tubo con el filtrado fue identificado y almacenado en un congelador de temperatura ultra baja marca Il Shin Bio Base (a -70°C) hasta el momento de su procesamiento.
La transcripción reversa de PCR en Tiempo Real cuantitativa (RT-qPCR) de
cada uno), muestra (ARN) (4µL). Los tiem- pos, ciclos y temperaturas programados en el Termociclador en tiempo real 7500 de Applied Biosystems para la RT-qPCR fueron los mismos estandarizados para las curvas de calibración de los ARNm de E7, E6 y E2: Estadio Inicial [37°C x 15 min]; Desnaturali- zación 95°C x 15 min; 40 Ciclos (95°C x 45s, 55°C x 60s, 72°C x 45s); Curva de Disocia- ción 60- 95°C en un período continuo.
El control de calidad de todas las extrac- ciones se realizó con una PCR en tiempo real para el ARNm del gen constitutivo GADPH, uti- lizando el Cebador directo: 5’-ACG GAT TTG GTC GTA TTG GG-3’ y el Cebador inverso: (5’-TGA TTT TGG AGG GAT CTC GC-3’ y sus
tiempos estandarizados para el gen; los contro- les negativos fueron procesados por triplicado y cada muestra fue procesada por duplicado.
La información recopilada de los resul- tados obtenidos durante la investigación, se analizó con el Programa estadístico IBM SPSS Statistics 22 para Windows; para el cálculo del porcentaje, coeficiente de corre- lación, correlación de Pearson, regresión li- neal, y la distribución de Fisher.
Al evaluar los datos de cada paciente se obtuvo un promedio general de 30,50 ± 10,01 años, siendo la media de edad para las mujeres establecida en 31,34 ±10,27 años y para los hombres la media fue de 28,88 ± 9,47 años.
En los pacientes estudiados, las lesio- nes de bajo grado estuvieron presentes en un
71,05%, mientras que las de alto grado estu- vieron presentes en el 28,95%. La frecuencia de coinfecciones por más de un genotipo de VPH fue de un 76,32%.
Todas las muestras arrojaron un resul- tado positivo para la presencia del VPH. La frecuencia de los genotipos de VPH se distri- buyó como se expone en la Tabla I, observán- dose que en el total de muestras prevaleció el VPH 6/11 de bajo riesgo oncogénico con un 44,74%, seguido del VPH 42 con 39,47%; mientras que entre los VPH de alto riesgo los más frecuentes fueron el VPH 16 con 31,58% seguido del VPH 18 con un 26,32%.
En lesiones de bajo grado el genoti- po VPH 6/11 se encontró en 55,55% de las muestras, seguido de los VPH 42, 16 y 18 con 29,63%; por otro lado, en lesiones de alto grado el VPH 16 prevaleció junto al VPH 51 con 36,36 %, mientras que los VPH 18, 31
y 33 aparecieron en un 18,18%.
La cuantificación de los ARN mensaje- ros solo fue realizada en muestras donde fue detectado el VPH 16, las cuales fueron 12 de 38 muestras, 31,56% del total evaluado. En la Fig. 1, se pueden apreciar las amplificacio- nes registradas durante el proceso de la RT-
TIPIFICACIÓN VIRAL Y CLASIFICACIÓN ANATOMOPATOLÓGICA DE LOS PACIENTES ESTUDIADOS
Tipo de VPH Bajo riesgo
Grado de lesión
Bajo grado Alto grado
En todas las lesiones histológicas
6/11 55,55% (15/27) 9,09% (1/11) 44,74% (17/38)
42 29,63% (8/27) 63,63% (7/11) 39,47 (15/38)
43 14,81% (4/27) 18,18% (2/11) 15,79% (6/38)
44 11,11% (3/27) 9,09% (1/11) 10,53% (4/38)
Alto riesgo
16 29,63% (8/27) 36,36% (4/11) 31,58% (12/38)
18 29,63% (8/27) 18,18% (2/11) 26,32% (10/38)
31 11,11% (3/27) 18,18% (2/11) 13,16% (5/38)
33 7,41% (2/27) 18,18% (2/11) 10,52% (4/38)
35 18,52% (5/27) 18,18% (2/11) 18,42% (7/38)
39 18,52% (5/27) 18,18% (2/11) 18,42% (7/38)
45 11,11% (3/27) 18,18% (2/11) 13,16% (5/38)
51 18,52% (5/27) 36,36% (4/11) 23,68% (9/38)
52 3,70% (1/27) 9,09% (1/11) 5,26% (2/38)
56 11,11% (3/27) 18,18% (2/11) 13,16% (5/38)
58 7,41% (2/27) 27,27% (3/11) 13,16% (5/38)
59 7,41% (2/27) 9,09% (1/11) 7,89% (3/38)
66 7,41% (2/27) 18,18% (2/11) 10,53% (4/38)
68 11,11% (3/27) 9,09% (1/11) 10,53% (4/38)
PCRq, en ellas están presentes: las curvas de calibración de E2, E6, E7, los controles ne- gativos y todas las muestras evaluadas para los 3 ARNm; se aclara, que los controles ne- gativos se encuentran por debajo del umbral o después del ciclo 30, criterio que los valida como negativos. La representación gráfica de las curvas de calibración y la ubicación de los resultados de las muestras evaluadas en cada uno de los ARNm evaluados se mues- tran en las Figs. 2, 3 y 4.
Las curvas de calibración mostraron las siguientes pendientes: Gen E7 (-2,22), Gen E6 (-3,86), Gen E2 (-3,68) con los coeficien-
tes de correlación (R2): Gen E7 (0,98), Gen E6 (0,99), Gen E2 (0,99). En la curva de di- sociación se obtuvieron temperaturas simi- lares: para E7 (78,33°C); para E6 (76,39°C) y para E2 (72,76°C) (Fig. 5).
Como comprobación de las amplifica- ciones de cada ARNm, posterior a la PCR en tiempo real se realizaron electroforesis en gel de agarosa al 2% para la observación de los productos amplificados junto al peso mo- lecular (Promega) escalado en 100 pb, ob- servando la presencia de las bandas especí- ficas y únicas: gen GAPDH (230 pb), gen E7 (115 pb), gen E6 (134 pb), gen E2 (149 pb).
Fig. 2. Curva de Calibración para el ARNm del Gen E7. La pendiente de la curva de calibración para el Gen E7 es de -2,22, su coeficiente de correlación es R2 = 0,98; los Ct obtenidos están dentro del rango aceptable (> 8 y < 35) además puede observarse que todas las muestras se mantienen dentro de la linealidad del método.
Fig. 3. Curva de Calibración para el ARNm del Gen E6. Pendiente = -3,86; Coeficiente de correlación R2 = 0,99 indicando una excelente relación entre los datos obtenidos en los puntos realizados en la curva de calibración; los Ct se mantuvieron en el rango esperado entre el ciclo 8 y el ciclo 35; solamente una muestra (Nº12) se salió de la linealidad de la metodología con una concentración más baja de lo esperado.
Fig. 4. Curva de Calibración para el ARNm del Gen E2. Presentando una Pendiente de -3,68 demuestra que hubo un proceso óptimo en la amplificación de la secuencia en el patrón utilizado; la relación entre el descenso de la concentración y el incremento del Ct fue el ideal R2 = 0,99; en esta curva de cali- bración fueron tres muestras (Nº 12, 23 y 29) las que estuvieron fuera de la linealidad del método por poseer poca cantidad del ARNm del Gen E2.
E2 72,76°C; siendo estos valo- res cercanos a los esperados, de igual forma se observaron los picos de fluorescencia úni- cos en los patrones y muestras evaluadas confirmando la au- sencia de contaminaciones en el proceso.
Los resultados obtenidos a partir de las curvas de calibración se muestran en la Ta- bla II, donde el ARNm de cada gen se expresa en #copias/µL. En las curvas de los genes E6 y E2 se observa que en algunas muestras (12, 23 y 29) los valores del Ct se mantu- vieron por debajo de la linealidad del méto- do, siendo indicativo de la poca cantidad de ARNm presente en la muestra; por lo tanto, las cantidades de ARNm obtenidas en los cálculos no son confiables, por ende, fueron excluidos de los análisis.
En la Fig. 6 se presenta el promedio de ARNm del gen E7 presente en las mues- tras, puede observarse el incremento de la expresión del gen viral E7 al aumentar el grado de la lesión que presentaba el pacien- te (R2= 0,36).
Al igual que otras investigaciones que sugieren que la infección por VPH ocurre durante la etapa de mayor actividad sexual, el promedio de edad de los pacientes coin- cidió con los promedios establecidos para hombres y mujeres infectados con VPH, en esas edades una gran cantidad de hombres y mujeres jóvenes no se realizan revisiones pe- riódicas, lo que explica la aparición de lesio- nes, incluyendo las de alto grado, alrededor de los 30 años (10, 19, 21).
Fue notable la frecuencia de coinfec- ciones por más de un genotipo de VPH; las coinfecciones resultan en un problema para el paciente, ya que diversos estudios, así como el presente, han demostrado que la
CUANTIFICACIÓN DE LOS ARNm DE LAS ONCOPROTEÍNAS VIRALES E7, E6, E2 EN MUESTRAS DE PACIENTES INFECTADOS CON VPH 16.
Paciente | Tipo de lesión | ARNm E7 [#copias/µL] | ARNm E6 [#copias/µL] | ARNm E2 [#copias/µL] | ARNm Total [#copias/µL] |
3 | Lesión genital externa | 760,993 | 194.984,46 | 11.220,18 | 206.965,64 |
5 | Neoplasia Intraepitelial Peneal I | 116,211 | 30.902,95 | 14.125,38 | 45.144,54 |
12 | Verrugas en labios mayores y menores | 245,668 | ** | ** | ** |
15 | Lesión Intraepitelial Cervical II | 185,419 | 390.484,71 | 85.776,75 | 476.446,89 |
23 | Lesión escamosa en Recto | 187,354 | 35.450,65 | ** | ** |
29 | Úlcera genital | 18,138 | 75.906,66 | ** | ** |
33 | Neoplasia Intraepitelial Anal II | 613,824 | 6.606.934,48 | 1.659.586,91 | 8.267.135,21 |
34 | Cambios por VPH | 118,896 | 69.183,09 | 147.910,84 | 217.212,83 |
35 | Neoplasia Intraepitelial Anal I | 185,804 | 11.481.536,21 | 1.698.243,65 | 13.179.965,67 |
36 | Cambios por VPH | 359,982 | 263.026,79 | 91.201,08 | 354.587,86 |
37 | Sin evidencias de malignidad | 157,529 | 1.412.537,54 | 123.026,88 | 1.535.721,95 |
38 | Células normales | 60,169 | 48.977,88 | 63.095,73 | 112.133,79 |
(**): Valores fuera de la linealidad del método.
presencia de diversos genotipos sobre todo los de alto riesgo, implica un incremento de la posibilidad de desarrollar cáncer (7). En pacientes con lesiones histológicas de bajo grado fue descubierto que la infección era con genotipos de alto riesgo, lo cual puede sugerir que esas lesiones pueden progresar a lesiones de alto grado y posteriormente a cáncer, como se han observado en otros es- tudios (22).
En lesiones de bajo grado el genotipo más frecuente fue el VPH 6/11, seguido de los VPH 42, 16 y 18, por otro lado, en lesio- nes de alto grado el VPH 16 prevaleció junto al VPH 51, mientras que los VPH 18, 31 y 33 estuvieron presentes con menor frecuencia; estos resultados coinciden con datos reco- pilados en Venezuela y a nivel mundial, de- mostrando que la permanencia de VPH de alto riesgo oncológico está relacionada con el avance de las lesiones (10, 19, 23). Se pue- de concluir que existe una prevalencia alta del VPH 16 entre los genotipos de alto ries- go en los pacientes, concordando con estu- dios anteriores en el país, del mismo modo se observó el incremento de la prevalencia
del VPH 51 por encima del VPH 18 el cual concuerda con estudios epidemiológicos re- cientes (18).
t
t
Las curvas de calibración, arrojaron pendientes cercanas a -3,3 indicando que el proceso fue óptimo; los coeficientes de co- rrelación (R2) fueron excelentes, ya que lo ideal es un R2> 0,99, estableciendo una re- lación directa entre los valores; y por último, los valores del Ciclo de Umbral (C ) se man- tuvieron entre >8 y < 35, esto se tomó en cuenta ya que cuando el C < 8 es indicativo de la existencia de mucho templado (ADN/ ARN) en la mezcla de reacción, y cuando el
C
t
>35 indica que el templado es escaso, esto causa en ambos casos el incremento de la desviación estándar.
Finalizada la RT-qPCR en tiempo real fueron revisadas las curvas de disociación de los patrones y las muestras evaluadas, y se observaron picos únicos de fluorescencia lo cual confirmó la ausencia de la contamina- ción durante el proceso.
Al evaluar la relación entre la expresión del gen E2 con la expresión del gen trans- formante E7 se observó muy poca relación
entre ellos (R2= 0,29), coincidiendo con la poca relación que se ha presentado en diver- sas investigaciones, en las cuales, incluso se ha observado una relación inversa entre la expresión de los genes transformantes y la expresión del gen E2, ya que este último tiende a quedar excluido al progresar la le- sión y el genoma del VPH es integrado al ge- noma de la célula (24-26).
La expresión del gen transformante E6 aumentó con respecto a la del gen E7 con un buen grado de correlación, esto demuestra una relación entre la expresión de los genes transformantes E6 y E7 y el progreso de la lesión, ya que, al incrementarse el tipo de lesión, la expresión de los ARNm de los ge- nes aumentaba proporcionalmente; este re- sultado concuerda con investigaciones de la presencia de estos ARNm en la progresión oncogénica de las lesiones (1, 3, 24). ). Los resultados obtenidos también fueron anali- zados con la correlación de Pearson, obte- niéndose valores de correlación similares a los obtenidos con los cálculos del coeficien- te de correlación: correlación positiva ρ = 0,23 entre la expresión de los ARNm de E7 y E2, y correlación positiva ρ = 0,18 entre la expresión de los ARNm de E6 y E7.
Con respecto al total de ARNm de los genes virales se observó que a mayor canti- dad de genotipos oncogénicos fue mayor la cantidad del ARNm presente, este resultado coincidió con los presentados en investiga- ciones dirigidas a relacionar la presencia de los ARNm de los genes transformantes E6 y E7 con el avance de la lesión (12, 25), respaldando el hecho que al aumentar la actividad del VPH posterior a su integra- ción en el genoma celular, se produce un incremento de la expresión de estos genes virales, llevando al progreso de la lesión y a la transformación a un estadio de mayor grado de desdiferenciación. También se hace la aclaratoria que en otro estudio que utilizó las mismas secuencias en los ceba- dores para la amplificación del ARNm de los genes E2 y E6, encontraron una amplifica- ción inespecífica al modificar los tiempos
y temperaturas utilizadas durante la exten- sión en el proceso de PCR en tiempo real (23), comentamos esto ya que los tiempos y temperaturas de la PCR en tiempo real fueron modificados y es posible que un pe- queño incremento no significativo en la cuantificación del ARN en las muestras, sea por la amplificación de las secuencias de ARN inespecíficas correspondientes a otros genotipos de VPH que estaban presentes en las muestras.
Al observar el incremento en las canti- dades del ARNm del gen E7, se puede de- cir que la evaluación de la expresión de los ARNm podría ser utilizada en el estudio de los pacientes con lesiones por VPH, siempre y cuando se hagan los avances correspon- dientes para establecer criterios diagnósti- cos y la reducción de costos que permita una aplicación clínica de la cuantificación de los ARNm virales (27).
La expresión de los ARNm virales del VPH podría ser utilizada en la evaluación de las lesiones en pacientes, ya que como se observó en este estudio su cuantificación permite establecer una diferencia entre le- siones simples (de bajo grado) y las lesiones pre-cancerosas (de alto grado). Hasta donde sabemos estos estudios de los genes trans- formantes del VPH 16 no se han realizado en Venezuela y por lo tanto no existe una base de datos a la cual se puedan comparar estos resultados.
Pacientes que ya hayan recibido la va- cuna contra el VPH o que presenten indicios de un proceso neoplásico por este virus, po- drían ser evaluados para lograr reducir las consecuencias de las infecciones por VPH, con aumento de los diagnósticos oportu- nos por medio de las técnicas de biología molecular como la PCR (28). En los pacien- tes post-tratados, los ensayos basados en la detección del ADN viral llevan la pauta en la actualidad, sin embargo, carecen de una sensibilidad suficiente que permita discernir entre una infección nueva o una persisten- te (28-30); por ello, si la cuantificación de los ARNm se desea utilizar para el control
de los pacientes, no solo es importante que la prueba posea una gran sensibilidad analí- tica, tiene además que tener sensibilidad a nivel clínico, y esta solo se logra evaluando a los pacientes indicados, es decir, aquellos que reúnan criterios establecidos (clínicos y epidemiológicos), ya que a partir de los re- sultados, los encargados del tratamiento to- marán la decisión de la conducta a seguir en el paciente (31).
En el año 2012 varias sociedades: Ame- rican Cancer Society (ACS), American So- ciety for Colposcopy and Cervical Pathology (ASCCP) y la American Society for Clinical Pathology (ASCP), concretaron diversos pa- rámetros para la evaluación de pacientes, explicando que las mujeres jóvenes debe- rían realizarse una citología cada tres años, sin la necesidad de la detección del VPH por PCR, tomando en cuenta que muchas de las lesiones que pudieran presentar se deberán a VPHs de bajo riesgo los cuales no progre- san a lesiones pre-cancerosas. Las mujeres mayores de 30 años, deberán realizarse la ci- tología de forma conjunta a la detección del VPH por procedimiento de PCR en períodos de cada cinco años (27). Aquí tendría gran utilidad la cuantificación de estos ARNm vi- rales, ya que aplicando estos parámetros se podrá lograr una mejor sensibilidad en cada caso en comparación a la simple detección del ADN del VPH oncogénico, lo que agili- zará el diagnóstico y tratamiento efectivo de las lesiones de alto grado (HSIL) (30); también es necesario realizar otras investi- gaciones enfocadas en el estudio de las pro- teínas virales E6 y E7, ya que el aumento de ellas es la verdadera causa de los cambios celulares. De esta forma se logrará afianzar un buen marcador de progresión (32-33).
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