DOI: https://doi.org/10.52973/rcfcv-e32167
Recibido: 11/07/2022 Aceptado: 14/08/2022 Publicado: 03/09/2022
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Revista Cientíca, FCV-LUZ / Vol. XXXII, rcfcv-e32167, 1 - 5
RESUMEN
La yema de huevo (YH) es un componente común de los diluyentes
de semen por su eficacia para proteger la membrana de los
espermatozoides del choque de frío durante la criopreservación y
además de ser rica en proteínas, vitaminas, antioxidantes y fosfolípidos.
No obstante, la YH es un componente no denido y al mismo tiempo
peligroso por el riego de transmisión de agentes patógenos, por
esta razón, es necesario evaluar el uso de otros componentes que
disminuyan este problema; una alternativa poco estudiada es alcohol
poli vinílico (APV). Por lo que en esta investigación se evaluó el efecto
del APV y la YH suplementados al diluyente TCG (tris, ácido cítrico,
glucosa) sobre la criosupervivencia de espermatozoides epididimarios
(EE) de perro. Para ello, se recuperaron EE mediante la técnica de ujo
retrógrado en 15 perros adultos orquiectomizados para conformar
cinco agrupaciones (4-6 muestras epididimarias / agrupación). Cada
muestra agrupada se dividió en dos alícuotas, que posteriormente
fueron diluidas y congeladas usando dos aditivos suplementados al
diluyente TCG: APV al 1% (peso/volumen –p/v– [TCG–APV] y yema
de huevo al 20% (volumen/volumen –v/v– [TCG–YH]. Posterior a la
descongelación, se analizaron las anormalidades morfológicas, la
vitalidad (eosina / nigrosina), la integridad de membrana plasmática
(ioduro de propido), y las variables cinemáticas (sistema CASA,
SCA-2018
®
). Los resultados demostraron que la vitalidad e integridad
de la membrana plasmática fueron superiores (P<0,05) en muestras
congeladas con TCG–YH, en comparación con aquellas muestras
congeladas con TCG–APV. Asimismo, las muestras congeladas con
TCG–YH obtuvieron valores post-descongelación más altos (P<0,05) de
variable cinemáticas como la motilidad total y progresiva, velocidades
promedio y rectilínea, índice de rectitud y frecuencia de batida de
agelo, en comparación con las muestras congeladas con TCG–
APV. En conclusión, la adición YH al medio TCG fue efectiva en la
congelación de EE de perro, ya que mejoró la vitalidad, integridad
de membrana plasmática y la cinética espermática; sin embargo, la
adición de 1% de APV no mejoró la respuesta a la criopreservación.
Palabras clave: Perro; semen epididimario; crioprotectores;
motilidad; CASA
ABSTRACT
Egg yolk (EY) is a common component of semen extenders due to its
effectiveness in protecting the sperm membrane from cold shock
during cryopreservation and it is also rich in proteins, vitamins,
antioxidants, and phospholipids. However, the EY is an undened
component and at the same time dangerous due to the risk of
transmission of pathogenic agents. For this reason, it is necessary
to evaluate the use of other components that reduce this problem.
An understudied alternative is polyvinyl alcohol (PVA). For this reason,
this investigation evaluated the effect of PVA and EY supplemented
with TCG diluent (tris, citric acid, glucose) on the cryosurvival of dog
epididymal spermatozoa (ES). For this, ES were recovered using the
retrograde ow technique in 15 orchiectomized adult dogs to form ve
pools (4-6 epididymal samples/pool). Each pooled sample was divided
into two aliquots, which were subsequently diluted and frozen using
two additives supplemented to the TCG diluent: 1% (w/v) PVA [TCG–
PVA] and 20% (v/v) egg yolk [TCG–EY]. After thawing, morphological
abnormalities, vitality (eosin/nigrosin), plasma membrane integrity
(propion iodide), and kinematic variables (CASA system, SCA-2018®)
were analyzed. The results demonstrated that the vitality and integrity
of the plasma membrane were superior (P<0.05) in samples frozen
with TCG–EY, compared to those samples frozen with TCG–PVA.
Likewise, the samples frozen with TCG–EY obtained higher post-thaw
values (P<0.05) of kinematic variables such as total and progressive
motility, average and rectilinear velocities, straightness index and
agellum beat frequency, compared to with frozen samples with
TCG–PVA. In conclusion, enhancement of EY to TCG medium was
effective in freezing dog ES, as it improved vitality, plasma membrane
body, and sperm kinetics; however, the addition of 1% PVA did not
improve the response to cryopreservation.
Key words: Dog; epididymal semen; cryoprotectants; motility;
CASA
Evaluación de dos diluyentes en la congelación de espermatozoides
epididimarios de perros (Alcohol poli vinílico y Yema de huevo)
Evaluation of two extenders in Canine epididymal spermatozoa freezing
(Polyvinyl alcohol and egg yolk)
Noelia López-Zhindón
1
* , Mauricio Dumas
3
, Xavier Samaniego
3
, Diego Galarza
3
y Daniel Argudo-Garzón
2
1
Universidad Católica de Cuenca, Unidad Académica de Ciencias Agropecuarias, Posgrado. Cuenca, Ecuador.
2
Universidad Católica de Cuenca, Unidad Académica de Ciencias Agropecuarias, Carrera de Medicina Veterinaria. Cuenca, Ecuador.
3
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Laboratorio de Biotecnología de la Reproducción Animal. Cuenca, Ecuador.
*
Correo electrónico: noelia.lopez.23@est.ucacue.edu.ec
Congelación de espermatozoides de perros / López-Zhindon y col. __________________________________________________________________
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INTRODUCCIÓN
La criopreservación de espermatozoides permite conservar
características fenotípicas y genotípicas de animales con un valor
genético superior y administrar estos recursos en diferentes
partes del mundo. De hecho, la congelación de espermatozoides
se ha convertido en una herramienta clave para el desarrollo de las
tecnologías de reproducción asistida (TRA) en animales domésticos
y silvestres (ejemplo: peligro de extinción) debido al aumento de la
posibilidad de reproducción y preservación [1, 2].
Durante la congelación, los espermatozoides son susceptibles
a diversas tensiones y estrés osmótico debido a la exposición de
soluciones hipertónicas provenientes de los diluyentes y agentes
crioprotectores. El estrés osmótico está condicionado por el
crioprotector que provoca que los espermatozoides se contraigan
debido al ujo y eujo de agua a través de la membrana plasmática
[12]. Otros autores han propuesto que el daño criogénico que sufren
los espermatozoides durante la congelación y descongelación
puede deberse a factores como el choque térmico, la formación
de hielo (intra y extracelular), la deshidratación, el aumento de la
concentración de sal y el choque osmótico [19, 28].
Los estudios sobre métodos de congelación de espermatozoides
de perros (Canis lupus familiaris) han considerado factores como los
diluyentes básicos (ejemplo: TCG o Tris, ácido cítrico y fructuosa
[TCF]) [6, 17], aditivos (ejemplo: YH), y glicerol para lograr altas tasas
de criosupervivencia espermática después de la descongelación.
La YH representa uno de los aditivos que aporta mayores benecios
para la congelación espermática, ya que protege a la célula del
choque de frío y conere una cierta protección durante el proceso de
congelación-descongelación [1]. Entre otras acciones, la YH previene
la pérdida de colesterol y fosfolípidos de la membrana espermática
[13]. En distintos protocolos de congelación de esperma de perro, la
YH ha sido adicionada al diluyente TCG al 15–20% (v/v) para congelar
espermatozoides provenientes de eyaculado [7] o del epidídimo [15].
Sin embargo, su desventaja radica en la posibilidad de transmisión de
enfermedades y el riesgo de contaminación bacteriana [5]. Además,
se ha informado que al usar la YH se encontraron vacuolas lipídicas y
otras partículas que intereren en la evaluación microscópica (grumos)
así como en los ensayos bioquímicos y metabólicos del semen [12, 14].
Por esta razón, se han considerado alternativas que permitan mantener
la criosupervivencia y fertilidad de los espermatozoides de perros.
El APV es un polímero sintético que tiene la capacidad de inhibir la
recristalización del hielo en agua pura a una concentración inferior a
1 miligramo·mililitro
-1
(mg·mL
-1
) [10]. Este hecho lleva a considerarlo
como un potencial crioprotector para los espermatozoides. La adición
APV a diluyentes de congelación de espermatozoides de perros es útil
para disminuir la concentración de glicerol y para evitar la formación
de cristales de hielo extra e intracelular [27].Recientes reportes
demostraron que la adición de 0,5 a 3% de APV a un diluyente a base de
Tris se puede utilizar como alternativa a la YH para la crioconservación
de espermatozoides de perros [20, 21]. Sin embargo, estos trabajos
fueron realizados en espermatozoides provenientes de semen
eyaculado. Hasta donde se sabe, no existe información con respecto
al uso de APV en la criopreservación de EE de perro.
Esta investigación planteó la hipótesis de que al adicionar el
1% (10 mg·mL
-1
) de APV al diluyente TCG y al usar 5% de glicerol
como crioprotector [27], podría mejorar la criosupervivencia
espermática debido al mejoramiento en la distribución eciente
de los cristales de hielo extracelular producido durante el descenso
de temperatura. Por lo tanto, en este trabajo se evaluó el efecto de
la suplementación de APV al diluyente TCG en comparación a la YH
sobre la criosupervivencia de EE de perro, basados en la cinemática,
integridad y funcionalidad de membrana plasmática y anormalidades
morfológicas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Todos los medios fueron preparados en el laboratorio de
Reproducción Animal de la Universidad Católica de Cuenca, Ecuador
y se utilizó reactivos de Sigma® Aldrich Co.
Diluyentes
El diluyente base usado para esta investigación fue el TCG–YH
(Tris 313,7 milimolar –mM–), Ácido cítrico 104,7 mM, Glucosa 30,3
mM y 50 microgramos·mililitro
-1
(µg·mL
-1
). A este diluyente base, se
adicionaron dos aditivos en estudio, la YH y el APV, y glicerol (5%,
v/v) como agente crioprotector.
Recuperación espermática y evaluación inicial
Un total de treinta epidídimos fueron recuperados mediante
ujo retrogrado, provenientes de quince perros adultos (2–8 años),
sexualmente maduros y sanos, que fueron sometidos a orquiectomía
bilateral. Previo a la castración, todos los perros fueron evaluados
en su condición general y su aparato reproductivo, y entonces su
aptitud para este estudio fue determinada.
La recuperación de EE se realizó mediante ujo retrógrado; para
esto, una aguja metálica N° 22 G×1 ½, cortada en su extremo punzante
fue introducida en el conducto deferente proximal y entonces 1 mL
del diluyente TCG previamente atemperado a 18°C en un refrigerador
(Indurama, RI-485, Ecuador), fue administrado. Para la evacuación
del contenido retrógrado, se hicieron unos cortes longitudinales en la
cola del epidídimo y el contenido espermático fue recogido en un vaso
de precipitación estéril. Inmediatamente, el contenido espermático
fue transferido a un tubo Eppendorf de 1,5 mL y se mantuvo a 36°C en
una platina térmica (Cryologic, BioTherm SmartPlate SPA5, Australia)
durante su análisis hasta su procesamiento.
Un total de 30 muestras de EE fueron recuperadas y entonces
cinco agrupaciones de semen (pools) fueron conformados (4–6
muestras epididimarias recolectadas / pool seleccionados de
forma aleatoria). A cada pool se le evaluó la motilidad individual
progresiva por un operador y la concentración espermática
mediante una cámara de Neubaüer (Marienfeld, Lauda- Königshofen,
Alemania) y un microscopio de contraste de fases (OLYMPUS® BX-51,
Japón), respectivamente. Aquellas muestras agrupadas con una
concentración mayor a 100×10
6
espermatozoides·mL
-1
y una Motilidad
Individual Progresiva mayor a 70% fueron usadas para el subsiguiente
trabajo experimental.
Dilución, tratamientos y congelación
Cada muestra agrupada fue dividida en dos alícuotas y diluidas
con dos diluyentes base a una concentración inicial de 100×10
6
espermatozoides·mL
-1
para conformar dos tratamientos:
1. TCG + 20% YH (TCG–YH)
2. TCG + 1% (p/v) APV (TCG–APV)
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Las muestras de ambos tratamientos se mantuvieron en
refrigeración (Indurama, RI-485, Ecuador), a 5°C durante 2 horas
(h) para su equilibramiento. Posteriormente, a cada muestra se
adicionó el mismo volumen (1:1) de los diluyentes base de cada
tratamiento (TCG-TY y TCG–APV) más 10% de glicerol. De esta
manera, las muestras alcanzaron una concentración nal de 50×10
6
espermatozoides·mL
-1
y 5% de glicerol. Inmediatamente, las muestras
espermáticas se cargaron en las pajuelas de 0,25 mL y se mantuvieron
en refrigeración a 5°C (Indurama, RI-485, Ecuador) durante 10 minutos
(min) adicionales. Luego las pajuelas se colocaron sobre una rampa
de otación (Minitube, Alemania) y se expusieron durante 15 min
en vapores de nitrógeno líquido (NL2) estático a una distancia de 5
centímetros sobre el mismo. Finalmente, las pajuelas se sumergieron
directamente en NL2 y fueron almacenadas en un termo (MVE, ET-20,
China) a -196°C hasta su evaluación.
Descongelación y análisis post congelación
La descongelación de las pajuelas de ambos tratamientos se realizó
en un baño María (Fanem, 1100, Brasil) con agua a 37°C durante 45
segundos. La vitalidad espermática y anormalidades morfológicas
fueron evaluadas mediante la tinción supravital de eosina (2%) y
nigrosina (10%). La integridad de la membrana plasmática (IMP) fue
evaluada mediante la tinción uorescente con ioduro de propidio
bajo microscopía de epiuorescencia (OLYMPUS
®
BX-51, Japón). Las
variables cinemáticas de los espermatozoides de perros congelados
y descongelados con ambos tratamientos fueron analizadas usando
un sistema CASA (Sperm Class Analyzer, SCA-Evolution
®
2018, versión
6.0.4 software, Microptic S.l., Barcelona, España). El sistema CASA
registró la motilidad espermática (MT,%), motilidad progresiva (MP,%),
velocidad curvilínea (VCL, μm·s
-1
), velocidad rectilínea (VSL, μm·s
-1
),
velocidad promedio (VAP, μm·s
-1
), rectitud (STR,%), linealidad (LIN,%),
oscilación (WOB,%), Frecuencia de batida de agelo (BCF, HZ), y la
amplitud de desplazamiento lateral de la cabeza (ALH, μm).
Análisis estadístico
El valor de cada variable fue calculada y presentada como promedio
+ error estándar de la media. Un GLM fue usado para comparar los dos
tratamientos en estudio (TCG–YH y TCG–APV). Además, en el modelo
se incluyó la “repetición” como variable de ajuste. La signicación se
jó en P<0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando
el software SPSS® (versión 23.0 para Windows, Chicago, USA).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la TABLA I se muestran los resultados obtenidos posterior a la
descongelación de las variables analizadas en los dos tratamientos. En
la TABLA II se detallan las variables cinemáticas de los espermatozoides
congelados y descongelados con ambos tratamientos. La vitalidad
e Integridad de la Membrana Plasmática fueron superiores (P<0,05)
en aquellas muestras congeladas con TCG–YH en comparación con
las muestras congeladas con TCG–APV. No se evidenció diferencias
significativas (P>0,05) en las anormalidades morfológicas de los
espermatozoides congelados con APV o YH.
En el análisis de las variables cinemáticas, las muestras congeladas
con TCG–YH obtuvieron valores post-descongelación más altos (P< 0,05)
de MT, MP, VAP, VSL, STR y BCF en comparación con aquellas muestras
congeladas con TCG–APV.
Los resultados de la presente investigación demuestran que la YH
protegió mejor a los EE de perro durante la congelación que el APV.
Por otro lado, la adición del 1% (10 mg·mL
-1
) de APV al diluyente TCG
produjo un efecto indeseable en criosupervivencia de espermatozoides
de perros basado en una baja tasa de vitalidad y cinética.
El proceso de congelación de semen causa efectos nocivos sobre a
motilidad total y progresiva, la integridad de la membrana plasmática
y el potencial de membrana mitocondrial de los espermatozoides [26];
es por ello que la YH se ha usado con éxito como crioprotector natural
en la congelación de semen de perro, es así que se comparó la YH con
el plasma de YH en un extensor a base de Tris, y se demostró que el
semen congelado con TRIS-YH mostró mejor motilidad progresiva, la
mayoría de células intactas, porcentaje más bajo de: ROS, daños en
el acrosoma, células muertas y apoptóticas [24]. En otro estudio se
probaron distintas combinaciones de crioprotectores extracelulares e
intracelulares y los resultaron mostraron que el uso de YH en combinación
con glicerol eran óptimos para una criopreservación exitosa [9]. Se
estudió la criopreservación de semen de perro en un diluyente Tris con
dos preparaciones diferentes de soja al 1 % en comparación con un
diluyente de YH, y se concluyó que la YH fue superior a cualquiera de los
dos diluyentes a base de lecitina de soja utilizados en dicho estudio [16].
TABLA I
Características del semen de perro post descongelación
Tratamiento
Vitalidad (%)
(X
̄
± EE)
IMP (%)
(X
̄
± EE)
Anormalidades
Morfológicas
(X
̄
± EE)
TCG–YH 44,5 ± 8,21
a
60,3 ± 1,07
a
47,4 ± 3,71
TCG–APV 15,5 ± 1,74
b
52,5 ± 1,46
b
48,8 ± 4,02
(X
̄
± EE): media + error estándar, YH: Yema de huevo, APV: Alcohol
polivinílico, IMP: Integridad de la Membrana Plasmática. Superíndices
diferentes en la misma columna indican diferencia signicativa entre
tratamientos (
a-b
P<0,05)
TABLA II
Características del semen de perro post descongelación, sistema CASA
Tratamiento
MT (%)
(X
̄
± EE)
MP (%)
(X
̄
± EE)
VCL (μm·s
-1
)
(X
̄
± EE)
VAP (μm·s
-1
)
(X
̄
± EE)
VSL (μm·s
-1
)
(X
̄
± EE)
STR (%)
(X
̄
± EE)
LIN (%)
(X
̄
± EE)
WOB (%)
(X
̄
± EE)
ALH (μm)
(X
̄
± EE)
BCF (Hz)
(X
̄
± EE)
TCG–YH 56,9 ± 16,2
a
10,5 ± 8,63
a
46,1 ± 10,98 25,0 ± 10,99
a
17,6 ± 7,45
a
63,2 ± 4,74
a
34,7 ± 7,15 52,6 ± 7,90 2,9 ± 2,22 4,5 ± 1,06
a
TCG–APV 24,9 ± 11,26
b
1,6 ± 1,98
b
37,3 ± 11,43 18,0 ± 6,55
b
10,6 ± 4,27
b
57,5 ± 5,63
b
32,1 ± 7,74 50,9 ± 6,72 2,1 ± 0,48 3,3 ± 1,19
b
(X
̄
± EE): media + error estándar, MT: motilidad total, MP: motilidad progresiva, VCL: velocidad curvilínea, μm·s
-1
: micrometro por segundo, VAP: velocidad
promedio, VSL: velocidad rectilínea, STR: porcentaje de rectitud, LIN: porcentaje de linealidad, WOB: porcentaje de oscilación, ALH: amplitud del
desplazamiento lateral de la cabeza, BCF: frecuencia de batido de agelo, Hz: hertzio. Superíndices diferentes en la misma columna indican diferencia
signicativa entre grupos (
a-b
P < 0,05)
Congelación de espermatozoides de perros / López-Zhindon y col. __________________________________________________________________
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A pesar de los resultados positivos con el uso de YH se buscan
alternativas para minimizar los efectos adversos que ésta pueda
causar. Se conoce que el APV es un polímero sintético que previene
la formación de hielo luego de la descongelación y además reduce el
punto de congelación lo que regula el balance iónico intracelular [11];
sin embargo, las concentraciones elevadas de APV puede provocar
toxicidad celular. Además, concentraciones elevadas del APV (1 y
2,5%) puede aumentar la viscosidad del medio [23] y provocar una
disminución de los parámetros cinéticos (motilidad, velocidades y
parámetros de relación de progresividad) como fue demostrado en
el presente estudio.
En investigaciones anteriores se determinó que la suplementación
de 0,05 a 0,3% (0,5 a 3mg·mL
-1
) de APV a diluyentes basado en Tris
produjo una mejoramiento de la motilidad progresiva e integridad de
la membrana plasmática y acrosomal [20, 21]. Se ha demostrado que
la combinación de APV (0,8%) y albúmina sérica bovina (BSA al 1, 4 y
6%) mostró efectos positivos sobre la motilidad en espermatozoides de
perros luego de la incubación post-descongelación en tres medios de
cultivo (TCM-199; Sp-TALP; y HTF) [22]. Por otro lado, se ha demostrado
que la suplementación con dosis bajas y altas de APV (0,1; 1 y 2%)
al diluyente TCG con 5% de YH produjo una mejor respuesta a la
criopreservación de espermatozoides de chivo (Capra aegagrus hircus)
[27] y carnero (Ovis orientalis aries) [25]. En otro estudio se reemplazó la
BSA por APV con el n de mejorar la motilidad, la reacción acrosómica
y la capacidad fertilizante in vitro de los espermatozoides de hámster
(Cricetinae); no obstante, los resultados no evidenciaron cambios en
la motilidad [4]. Del mismo modo, se estudió la vitricación in vitro
de ovocitos bovinos (Bovinae) maduros usando APV al 0,05; 0,1; 0,5 y
1 %; la tasa más alta de embriones que alcanzaron la etapa de mórula
después de la vitricación se obtuvo en una solución reforzada con APV
al 0,1% [3, 8]. Los resultados del presente estudio son inconsistentes
a los resultados expuestos en los estudios anteriores, debido a que
ellos usan dosis bajas y altas de APV y la criorespuesta fue deseable (o
la esperada) [25, 27]. Esto quizá permite especular que la respuesta a
la criopreservación con la suplementación de APV es diferente entre
especies y tipos de células.
Se realizó una revisión sobre las alternativas a la YH como
crioprotectores en la congelación del semen de perro, entre ellas
lipoproteínas de baja densidad, plasma de YH, lectina de soya, leche
descremada y APV; pero se concluye que a pesar de los riesgos de
contaminación cruzada al usar YH, sigue siendo la más usada y con
mejores resultados, las alternativas a éste muestran resultados
prometedores pero son necesarios más estudios [18].
CONCLUSIONES
La adición YH al medio TCG fue efectiva en la congelación de EE
de perro debido a que mejoró la vitalidad, integridad de membrana
plasmática y la cinética espermática. La adición de 1% de APV no
mejoró la respuesta a la criopreservación, no obstante, se necesitan
más estudios en los que se pruebe otras concentraciones y, asimismo,
evaluar los efectos especícos del APV sobre los espermatozoides
de perro.
AGRADECIMIENTOS
Los autores dejamos constancia de nuestro agradecimiento a los
laboratorios de Biotecnología y Reproducción Animal de la Universidad
Católica de Cuenca y Universidad de Cuenca.
Conicto de intereses
Los autores certican que no existen conictos de interés en el
presente trabajo.
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