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MARACAIBO, ESTADO ZULIA, VENEZUELA
Vol. XXX (2) 2020
UNIVERSIDAD DEL ZULIA
REVISTA CIENTÍFICA
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
DIVISIÓN DE INVESTIGACIÓN
82
Caracterización de polimorsmos / Salazar; S. y col.
CARACTERIZACIÓN DE POLIMORFISMOS DEL GEN LEPTINA EN
SEMENTALES DE LA RAZA CARORA
Characterization of Leptin gene polymorphisms in Carora sires
Saúl Salazar-Sequea
1
, Oscar De La Rosa
2
*, Alexis Marques-Urdaneta
2
, Lourdes Vilanova F
3
y Belkys Vasquez-Marin
2
1
Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, Producción Animal.
2
Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, Laboratorio de
Biotecnología Agrícola.
3
Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, Cátedra de Reproducción Animal.
Correspondencia: delarosa100@gmail.com.
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo fue caracterizar los polimorsmos
nucleótidicos simples (SNP) LepClaI (rs29004487), LepKpn2I
(rs29004488), LepHphI (rs29004508) y LepSau3AI (rs29004501)
del gen Leptina, en toros reproductores de la raza Carora. Se
colectaron muestras de sangre y semen de 43 toros nacidos entre
2002 y 2013 para la extracción de ADN; éste se obtuvo a partir de
metodologías de precipitación salina. Las genotipicaciones se
realizaron a través del análisis de la longitud de los fragmentos
de restricción de un producto amplicado (PCR-RFLP) y
mediante un sistema de amplicación con cuatro cebadores,
refractario a mutaciones (TETRA PRIMER PCR). Los productos
de amplicación y digestión fueron vericados en electroforesis
horizontal en geles de agarosa. Se calcularon las frecuencias
alélicas y genotípicas, la heterocigosidad observada (Ho),
y se probó el equilibro de Hardy – Weinberg. Las frecuencias
alélicas y genotípicas fueron respectivamente 0,98(A), 0,02(T)
y 0,95(AA), 0,05(AT) para el polimorsmo rs29004487; 0,59(C),
0,41(T) y 0,14(CC), 0,53(CT), 0,33(TT) para rs29004488; 0,8(C),
0,2(T) y 0,67(CC), 0,26(CT), 0,07(TT) para rs29004501; 0,94(C),
0,06(T) y 0,88(CC), 0,12(CT) para rs29004508. No se observaron
desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg y se evidencia
la existencia de desequilibrio de ligamiento entre la mayoría
de los SNP estudiados. Las frecuencias alélicas y genotípicas
de los polimorsmos evaluados en la población de toros de
raza Carora, son similares a las obtenidas en otras razas. Esta
primera aproximación en la caracterización del gen Leptina en
ganado Carora, permitirá considerar el potencial genético de la
raza para la producción de leche o de carne.
Palabras clave: Alelo; bovino; genotipo; leptina; polimorsmo
ABSTRACT
The objective of this work was to characterize the LepClaI
(rs29004487), LepKpn2I (rs29004488), LepHphI (rs29004508)
and LepSau3AI (rs29004501) single nucleotide polymorphisms
(SNP) of the Leptin gene in Carora sires. Blood and semen samples
were collected from 43 bulls born between 2002 and 2013 for
DNA extraction; this was obtained from salting out methodologies.
Genotyping was carried out through the PCR-RFLP analysis and
by an amplication system with four primers, refractory to mutations
(TETRA PRIMER PCR). The amplication and digestion products
were veried in horizontal electrophoresis in agarose gels. Allelic
and genotypic frequencies, observed heterozygosity (Ho) were
calculated, and Hardy-Weinberg equilibrium was tested. Allelic
and genotypic frequencies were respectively 0.98(A), 0.02(T)
and 0.95(AA), 0.05(AT) for rs29004487 polymorphism; 0.59(C),
0, 41(T) and 0.14(CC), 0.53(CT), 0.33(TT) for rs29004488;
0.8(C), 0.2(T) and 0.67(CC), 0.26(CT), 0.07(TT) for rs29004501;
0.94(C), 0.06(T) and 0.88(CC), 0.12 (CT) for rs29004508. No
deviations from Hardy-Weinberg equilibrium were observed and
the existence of linkage disequilibrium was evident among the
majority of SNPs studied. The allelic and genotypic frequencies of
the polymorphisms evaluated in the Carora bull population were
similar to those obtained in other breeds. This rst approach in
the characterization of the Leptin gene in Carora cattle will allow
to consider the genetic potential of the breed for the production
of milk or meat.
Key words: Allele; bovine; genotype; leptin; polymorphism
Recibido: 11/03/2020 Aceptado: 20/05/2020
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Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXX, N° 2, 82 - 93, 2020
INTRODUCCIÓN
La Leptina es una proteína constituida por 146 aminoácidos y
16 Kilodaltons (Kda) de peso molecular, altamente conservada,
con una homología entre 84 – 97 % en las especies bovina (Bos
taurus), ratón (Mus musculus), humana, cerdos (Sus scrofa) y
ovejas (Ovis aries) [9, 17, 25]. Es secretada principalmente por el
tejido adiposo, una vez en circulación es transportada al cerebro
donde estimula factores que intervienen en funciones biológicas
tales como: saciedad, regulación del sistema neuroendocrino,
gasto energético, hematopoyesis, angiogénesis, pubertad y
reproducción; igualmente interviene en la adaptabilidad y función
inmune [1, 19, 21]. Esta hormona regula su propia expresión
mediante mecanismos de retroalimentación y mientras mayor
sea el número de adipocitos, mayor será la concentración de
Leptina en suero [5, 22].
Esta hormona es codicada por el gen Leptina (LEP), identicado
por mapeo físico del gen en ratones decientes en Leptina (ob/
ob) [62]. Posteriormente fue localizado en el cromosoma 4 región
q32 en bovinos (Bos taurus-Bos indicus) [53]. Contiene más de
15.000 pares de base (pb), y consta de 2 intrónes y 3 exónes
[12]. Las regiones codicantes se encuentran ubicadas en los
exones 2 y 3, y las mismas presentan varios polimorsmos que
han sido asociados con características de interés económico
en el ganado bovino, como contenido de grasa en la canal,
consumo de alimentos, peso vivo, balance energético, fertilidad,
producción de leche y rendimiento proteico en leche [10, 20, 32,
34, 35]. Entre los polimorsmos nucleotídicos (SNP) identicados
en este gen y evaluados en análisis de asociación genética se
encuentran rs29004487 y rs29004488, ubicados en el exón 2,
rs29004508 ubicado en el exón 3 y rs29004501 identicado en el
intrón 2 [10, 28, 32, 40, 42].
Los estudios mencionados resaltan la importancia del gen
LEP en el metabolismo lipídico y crecimiento de los animales
domésticos, así como en la regulación del desempeño productivo
de los rebaños; esto último ha generado gran interés para la
evaluación de LEP como un gen candidato para estudios de
asociación genética que permitan predecir el comportamiento
productivo y reproductivo del ganado bovino. En Venezuela,
se han realizado algunos reportes en ganado Carora y Criollo
Limonero [51, 56]; no obstante, se desconoce la distribución de
los polimorsmos de LEP arriba mencionados, en los rebaños
Carora.
La raza Carora constituye un recurso zoogenético valioso para
el país. Es una raza sintética, nativa de Carora, estado Lara,
Venezuela. Fue conformada a partir del ganado criollo Amarillo de
Quebrada Arriba y la raza Pardo Suizo, lo que la convirtió en una
raza adaptada al clima tropical y con buena producción de leche
[3]. Su proceso de formación se inició en los años 30, con semen
de toros Pardo Suizo proveniente de Europa y Norteamérica y
luego continuó con el uso de toros mestizos con la nalidad de
mantener su adaptación al ambiente tropical [11]. Para el año
2007, la producción promedio de esta raza para 305 días (d),
era cercano a los 3500 kilogramos (kg) [11, 49]. Posee rasgos
favorables en cuanto a mansedumbre, fortaleza, vigor y buena
reproducción, además, la selección natural favoreció genes
especícos del criollo [11], lo que le aporta rusticidad, capacidad
de adaptación al clima y de aprovechamiento de los forrajes
tropicales. Se ha consolidado como una raza lechera tropical,
producto del programa de mejoramiento genético implementado
por la Asociación de Criadores de ganado Carora (ASOCRICA) y
el Centro de Inseminación Articial Carora (CIAC) [11].
El ganado Carora es utilizado en ambientes tropicales con
un amplio rango de temperaturas (22 a 38 ºC), humedad por
encima del 90 %, y bajo diferentes sistemas de producción,
desde extensivos con pastoreo y ordeño manual en presencia
del becerro, hasta sistemas intensivos caracterizados por la
suplementación con alimentos concentrados, ordeño mecánico
y alto rendimiento lechero [11].
Además de su potencial lechero, la raza Carora es utilizada
en el cruzamiento con razas Bos indicus para la obtención de
animales “doble propósito”, por lo que la caracterización de
los polimorsmos del gen Leptina que han sido asociados con
rasgos de producción lechera y cárnica en estudios previos,
puede contribuir al conocimiento de la arquitectura genética de
estos rasgos complejos, además permitiría optimizar el proceso
de selección de rasgos de importancia económica en esta raza.
Fundamentado en lo anterior, el objetivo del presente estudio
fue caracterizar los polimorsmos rs29004487, rs29004488,
rs29004508 y rs29004501 del gen LEP, en un plantel seleccionado
de sementales de la raza Carora.
MATERIALES Y METODOS
Muestra poblacional y manejo general de los animales
Las muestras analizadas se colectaron a partir de 43 toros
raza Carora pertenecientes al plantel de reproductores del CIAC,
ubicado en Carora, municipio Pedro León Torres, estado Lara,
Venezuela, nacidos entre los años 2002 y 2013.
Los reproductores del CIAC son seleccionados por la
ASOCRICA, con base en los valores genéticos de sus
progenitores mediante la optimización del índice de pedigrí
y de los coecientes de relaciones [11]. Por lo general, estos
animales ingresan al CIAC a partir del tercer d de nacido. No
obstante, esto puede variar de acuerdo a la ubicación de la nca
de procedencia. El manejo alimenticio consiste en el suministro
de pasto ad libitum, complementado con silo de naranja (Citrus x
sinensis) y minerales; adicionalmente se les suministra alimento
concentrado, cuya ración aumenta en la medida en que los
animales crecen, hasta alcanzar una cantidad entre 3 a 4 kg.d
-1
.
La extracción de semen se inicia cuando los animales alcanzan
el año de edad; esta se realiza cada 7 d, dos veces.d
-1
. La rutina
previa de trabajo consiste en baños, recortes de pelos del
prepucio y lavados prepuciales con 20 mililitros (mL) de citrato
de sodio al 2,9 %; al momento de la extracción se utiliza un toro
de aproximadamente la misma altura como maniquí y se realiza
un par de montas falsas antes de extraer el semen con vagina
articial.
Extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN)
El ADN genómico se aisló mediante metodologías de
precipitación salina [16, 50], a partir de 18 pajuelas de semen
84
Caracterización de polimorsmos / Salazar; S. y col.
congelado y 25 muestras sanguíneas, estas últimas fueron
obtenidas por medio de punción de la vena coccígea, mientras
que las pajuelas de semen fueron obtenidas durante las
colectas rutinarias de semen que se realizaron en el Centro de
Inseminación.
Para el aislamiento del ADN a partir de sangre, se dispensaron
400 microlitros (μL) de cada muestra y se solubilizaron con 1000
μL de un tampón contentivo de TrisCl 20 milimolar (mM), pH
7,6, luego se incubaron a temperatura ambiente por 10 minutos
(min). Posteriormente, las muestras fueron centrifugadas a
20.800 g (fuerza centrífuga relativa) por 20 segundos (seg)
y el sobrenadante fue descartado. Las pastillas resultantes
fueron incubadas en una solución de lisis contentiva de ácido
etilen diaminotetraácetico (EDTA 1 mM), Tris-Cl (10 mM), 0,1%
de dodecil sulfato sódico (SDS), pH 8 a temperatura ambiente
durante 20 min. El ácido ribonucleico (ARN) fue lisado agregando
2,5 µL de ribonucleasa (Invitrogen®) y se incubó por 30 min a
37 ºC. Los residuos proteicos fueron digeridos con 2,5 μL de
proteínasa K a una concentración de 20 miligramos por mililitro
(mg.mL
-1
) durante 4 horas (h) a 55 ºC. Luego se utilizó acetato
de potasio (CH
3
CO
2
K), 5 molar (M) para precipitar los residuos
peptídicos mediante centrifugación a 20.800 g. El sobrenadante
fue mezclado con una solución de etanol absoluto (C
2
H
5
OH) y
acetato de sodio (C
2
H
3
NaO
2
) 0,12 M, con la nalidad de provocar
la precipitación del ADN. El ADN aislado fue lavado dos veces
con etanol al 70 % y solubilizado en un tampón de conservación
contentivo de Tris (10 mM), EDTA (1 mM), pH 8.
Para el aislamiento de ADN a partir de semen, se dispensaron
30 μL de cada muestra y fueron incubadas en una solución de
lisis (Tris 10 mM; cloruro de potasio (KCl) 50 mM; polisorbato
20 (Tween 20) 4,4 mM; Ditiotreitol (DTT) 25 mM), y los
residuos proteicos fueron digeridos con proteínasa k (2,5 μL;
20 mg.mL
-1
) durante 6 h a 55 ºC y 300 rpm (revoluciones por
min). Posteriormente se utilizó 150 µL de acetato de potasio 5 M,
para precipitar los residuos peptídicos mediante centrifugación
a 20.800 g. El sobrenadante fue mezclado con 700 µL de una
solución de Cloroformo (CHCl
3
) / Isopentanol (C
5
H
11
OH) (24:1),
se centrifugó a 20.800 rcf. El sobrenadante fue mezclado con
una solución de etanol absoluto y acetato de sodio 0,12 M con la
nalidad de provocar la precipitación del ADN. El ADN aislado fue
lavado dos veces con etanol al 70% y solubilizado en un tampón
de conservación (Tris 10 mM; EDTA 1 mM; pH 8).
Luego de nalizados los procesos de extracción de ADN, la
concentración del mismo se midió por espectrofotometría a 260
nanómetros (nm).
Polimorsmos evaluados y amplicación de ADN
El número de referencia del Centro Nacional de Biotecnología
(NCBI), ubicación genómica de los SNP estudiados y las
secuencias de los cebadores utilizados se presenta en la
TABLA I.
Para evaluar los SNP rs29004487 y rs29004501, se realizaron
amplicaciones en tiempo nal, con el uso de cebadores
descritos en la bibliografía [29]. En cuanto a los SNP rs29004488
y rs29004508, se utilizó un sistema de amplicación con cuatro
cebadores (dos internos y dos externos), refractario a mutaciones,
denominado TETRA PRIMER PCR [60], en la cual se obtienen
TABLA I
POLIMORFISMOS NUCLEOTÍDICOS SIMPLES DEL GEN LEP REVISADOS
Y SECUENCIAS DE LOS OLIGONUCLEÓTIDOSUTILIZADOS
Identicación Ubicación Oligonucleótidos Fabricante
rs29004487 Exón 2
5’-GATTCCGCCGCACCTCTC-3’
5’-CCTGTGCAAGGCTGCACAGCC-3’
Eurogentec
rs29004488 Exón 2
5’-TGTCTTACGTGGAGGCTGTGCCCAGCT-3’
5’-AGGGTTTTGGTGTCATCCTGGACCTTTCG-3’
5’-GACGATGTGCCACGTGTGGTTTCTTCTGT-3’
5’-CGGTTCTACCTCGTCTCCCAGTCCCTCC-3’
Macrogen
rs29004501 Intrón 2
5’-CAAGCCCTCTTCAGATACAACC-3’
5’-ATTCAGGGAGGGTCACTTGC-3’
Eurogentec
rs29004508 Exón 3
5’-TTTGTCCAAGATGGACCAGACATTTGT-3’
5’- ACTGGTGAGGATCTGTTGGTAGAGCG-3’;
5’-CTCTCTCCCACTGAGCTCTTGCTCTC-3’
5’-GGAGTA GAGGGAAGCTTCCAGGACAA-3’
Macrogen
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Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXX, N° 2, 82 - 93, 2020
FIGURA 1. FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN DE LEPClaI (rs29004487) EN EL EXÓN 2 DEL GEN LEPTINA DIGERIDOS CON LA
ENZIMA ClaI
TABLA II
COMPOSICIÓN DE LA MEZCLA DE PCR PARA LA AMPLIFICACIÓN DE LOS FRAGMENTOS DEL GEN LEP EN TOROS CARORA
Componente rs29004487 rs29004501 rs29004488 rs29004508
Agua 6,69 µL 7,73 µL 4,78 µL 4,94 µL
Buer (5X) 1X 1X 1X 1X
MgCl
2
(25 mM) 2,1 mM 1,6 mM 1,5 mM 1,5 mM
dNTPs (10 mM) 0,2 mM 0,05 mM 0,05 mM 0,05 mM
CF (10 µM) 0,2 µM 0,2 µM - -
CR (10 µM) 0,2 µM 0,2 µM - -
CFRI (10 µM) - - 1 µM 1 µM
CFRE (10 µM) - - 0,2 µM 0,15 µM
Taq Polimerasa
(5 U/µL)
0,75 U 0,7U 0,7 U 0,6 U
ADN 60 ng 50 ng 50 ng 50 ng
Buer: tampón de ampicación; MgCl
2
: cloruro de magnesio; dNTPs: desoxiribonucleótidos fosfatados; CF: cebador forward; CR: cebador reverse; CFRI:
cebador forward y reverse internos; CFRE: cebador forward y reverse externos; Taq polimerasa: enzima polimerasa
TABLA III
PERFILES DE TEMPERATURA PARA LA AMPLIFICACIÓN DE LOS FRAGMENTOS DEL GEN LEP EN TOROS CARORA
Fase rs29004501 rs29004488 rs29004508
Desnaturalización inicial 95ºC (5 min) 95ºC (3 min) 95ºC (3 min)
Ciclos
Desnaturalización 95ºC (30 seg) 95ºC (1 min) 95ºC (1 min)
Alineamiento 57,5ºC (30 seg) 69,8ºC (35 seg) 66°C (35 seg)
Extensión 72ºC (40 seg) 72ºC (1 min) 72ºC (1 min)
Extensión nal 72ºC (10 min) 72ºC (5 min) 72ºC (5 min)
86
Caracterización de polimorsmos / Salazar; S. y col.
FIGURA 2. FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN DE LEPSau3AI (rs29004501) EN EL INTRÓN 2 DEL GEN LEPTINA DIGERIDOS CON
LA ENZIMA Sau3A1
FIGURA 3) AMPLICONES DE LEPKpn2I (rs29004488) EN EL EXÓN 2 DEL GEN LEPTINA
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Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXX, N° 2, 82 - 93, 2020
tres fragmentos de ADN. Para rs29004488 se utilizó un conjunto
de cebadores descritos en trabajos previos [14]. En referencia al
SNP rs29004508, se diseñó un conjunto de cebadores mediante
el programa Primer 1 [13].
Las reacciones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
para los cuatro polimorsmos evaluados se realizaron en un volu-
men de mezcla total de 15 µL; los componentes del tampón para
la reacción de amplicación se describen en la TABLA II.
Los perles térmicos para rs29004501, rs29004488 y
rs29004508, se detallan en la TABLA III. El SNP rs29004487,
se amplicó mediante un perl térmico que incluyó una metod-
ología Touch Down [30], que se describe brevemente: desnatu-
ralización inicial de 95 ºC min, 12 ciclos de: 95 ºC (30 seg), 65,4
ºC (30 seg), 72 ºC (45 seg), con disminución de la temperatura
de alineamiento en 1 ºC en cada ciclo hasta ubicarse en 53,4 °C,
seguido de 18 ciclos de: 95 ºC (30 seg), 53,4 ºC (30 seg), 72 ºC
(45 seg) y una extensión nal de 72 ºC (10 min).
Genotipicación
La genotipicación de rs29004487 y rs29004501 se realizó
a través del análisis de la longitud de los fragmentos de
restricción de un producto amplicado (PCR-RFLP); para el
caso de rs29004488 y rs29004508, el sistema de amplicación
TETRA PRIMER PCR utilizado [60], requiere de un único
paso de amplicación por PCR, a partir del cual se realiza la
genotipicación. El primer fragmento amplicado rs29004487,
que tiene una longitud de 466 pares de bases (pb), fue sometido
a una digestión simple con la enzima de restricción ClaI, en un
volumen total de 20 µL que contenía: 6,8 µL de agua ultra pura,
2 µL de Buer C 10X Promega®; 0,2 µL de BSA (Bovine Serum
Albumine) 0,1 mg.ml
-1
; 1 µL de ClaI 10 U.µL
-1
; 10 µL de ADN
amplicado.
Buer: tampón de ampicación; MgCl
2
: cloruro de magnesio;
dNTPs: desoxiribonucleótidos fosfatados; CF: cebador forward;
CR: cebador reverse; CFRI: cebador forward y reverse internos;
CFRE: cebador forward y reverse externos; Taq polimerasa:
enzima polimerasa
El segundo fragmento amplicado rs29004501 (570 pb) se
sometió a una digestión simple con la enzima de restricción
Sau3AI en un volumen total de 20 µL que contenía: 8,8 µL de
agua ultra pura; 2 µL de buer C 10X (Promega®); 0,2 µL de BSA
0,1 mg.ml
-1
; 1 µL de Sau3AI 10 U.µL
-1
; 8 µL de ADN amplicado.
Ambas reacciones se incubaron a 37 ºC durante 4 h.
Los productos de amplicación y digestión enzimática obtenidos,
fueron vericados mediante electroforesis horizontal en geles de
agarosa al 1,5 y 2,5 %, respectivamente.
Análisis de la estructura genética poblacional
Se calcularon las frecuencias alélicas y genotípicas, la
heterocigosidad observada (H
o
) e índice de diversidad genética
de Nei [43]. Así mismo, se probó el equilibro de Hardy – Weinberg
(HW) mediante el algoritmo de Levene [33], con estimaciones de
χ
2
y de razón de verosimilitud (G
2
). Se calculó el indice de jación
F
is
[58] y se estimó el desequilibrio de ligamiento (DL), a través
de la medida compuesta de Burrows y pruebas de signicancia χ
2
[57]. Para realizar estos análisis se utilizó el programa POPGENE
1.32 [61].
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Productos de amplicación y genotipicación obtenidos
En el estudio del polimorsmo rs29004487 se obtuvo un
producto de amplicación con el tamaño esperado (466 pb). El
alelo T no presenta sitio de reconocimiento para la enzima ClaI,
por lo que permanece sin digerir; mientras que el alelo A posee el
sitio de reconocimiento y el resultado de la digestión enzimática
FIGURA 4) AMPLICONES DE LEPHphI (rs29004508) UBICADO EN EL EXÓN 3 DEL GEN LEPTINA
88
Caracterización de polimorsmos / Salazar; S. y col.
se corresponde con dos fragmentos de 252 pb y 214 pb (FIG. 1).
Para rs29004501, se obtuvo un producto de amplicación
con el tamaño esperado (570 pb). El alelo C presenta un sitio
de reconocimiento para la enzima Sau3AI, por lo que se
observaron dos fragmentos de 357 pb y 213 pb como productos
de digestión (FIG. 2); mientras que el alelo T presentó dos sitios
de reconocimiento por lo que se evidenció la presencia de tres
fragmentos (357, 124 y 89 pb).
Para rs29004488 se obtuvieron tres fragmentos correspondientes
a un segmento control de 239 pb, el alelo T de 131 pb y el alelo
C de 164 pb (FIG. 3).
Finalmente, en el estudio de rs29004508, se observó la presencia
de un fragmento control de 322 pb, así como de un fragmento de
212 pb que corresponde al alelo T y un fragmento de 163 pb que
identica al alelo C (FIG. 4).
Alelos y genotipos presentes
Se observaron dos alelos (A y T) y dos genotipos (AA y AT)
en el polimorsmo rs29004487, el genotipo TT no fue detectado.
Para el SNP rs29004488, se observaron dos alelos (C y T) y
tres genotipos (CC, CT, TT); mientras que en el polimorsmo
rs29004501, se evidenciaron dos alelos (C y T) y tres genotipos
(CC, CT, TT). Finalmente, rs29004508 presentó dos alelos (C y
T) y dos genotipos (CC / CT); el genotipo TT no fue observado.
Se ha reportado que el SNP rs29004487 promueve una
transversión nucleotídica de adenina a timina (A/T) en el exón
2 que resulta en una sustitución aminoacídica no conservativa
de tirosina a fenilalanina, en la proteína, [32]. En el caso del
polimorsmo rs29004488, causa una transición de citosina a
timina (C/T) en el exón 2 que genera un reemplazo aminoacídico
de arginina a cisteína, en la proteína, [29]; este último, es un
cambio no conservativo que altera la estructura de la proteína
e impide la identicación por parte de los receptores en el
hipotálamo, lo que origina cambios importantes en la acción
hormonal y altera la regulación sobre las características de
importancia económica [39].
En cuanto al SNP rs29004508, se ha reportado que promueve
una transición de timina a citosina (T/C) en el exón 3, la cual
resulta en un cambio aminoacídico conservativo de valina a
alanina, en la proteína [29]. Por último, el SNP rs29004501,
promueve una transición citosina a timina C/T en la secuencia
del intrón 2 [47]. Alteraciones nucleotídicas en estas regiones
resultan importantes, ya que, aunque los intrones no se traducen
a proteína, cambios en su estructura pueden modular la expresión
del gen.
En esta investigación, el SNP rs29004487 mostró frecuencia
alta para el alelo A (0,98), así como del genotipo AA (0,95) (TABLA
IV). Resultados similares se han reportado en animales British
Friesian, Aberdeen Angus, Hereford, Highland y Charolais, con
frecuencias de 0,96; 0,96; 0,88; 1,00 y 0,85 para el alelo A, y
de 0,04; 0,04; 0,12; 0,00 y 0,15 para el alelo T, respectivamente
[32]. Al igual que en las razas British Friesian, Aberdeen Angus
y Highland, en la raza Carora no se evidenció el genotipo TT.
Situación similar fue descrita en ganado Nelore, con frecuencias
alélicas de 0,999 y 0,001 para los alelos A y T, respectivamente,
y frecuencias genotípicas de 0,998 y 0,002 para los genotipos AA
y AT, sin detección del genotipo TT [15].
En cuanto al SNP rs29004501, se evidenció mayor frecuencia
del alelo C (0,80) con respecto al alelo T (0,20) (TABLA IV). Este
patrón de frecuencias es similar al reportado por Kasprzak-
Filipek y col. en razas nativas de Europa Central, en las cuales
se detectaron frecuencias de 0,69 y 0,31 para los alelos C y T
[26], Moravcikova y col. reportaron frecuencias alélicas de 0,896
y 0,103 para C y T en vacas Pinzgau [40], mientras que Öner y
col. obtuvieron frecuencias de 0,76 y 0,24 para C y T, en vacas
Holstein turcas [46]. En cuanto a los genotipos, los resultados de
la presente investigación muestran frecuencias que se pueden
denir como alta, media y baja para los genotipos CC, CT y TT,
respectivamente; este esquema es similar al reportado en otros
estudios donde se evidenciaron frecuencias de 0,80; 0,193 y
0,0063 [40, 46].
En la evaluación del SNP rs29004488 se identicó al alelo T
como el más frecuente, mientras que el alelo C resultó el menos
frecuente, con valores de 0,59 y 0,41, respectivamente (TABLA
IV); estos resultados son similares a los reportados en las razas
Angus y Hereford (0,58 y 0,55), y son superiores a los detectados
(0,34 y 0,32) en las razas Charolais y Simmental [10]. En el caso
del alelo C se observan frecuencias similares a las descritas en las
razas Angus y Hereford (0,42 y 0,45) e inferiores a las reportadas
en Charolais y Simmental (0,66 y 0,68). Los resultados obtenidos
muestran diferencias en cuanto a las frecuencias alélicas de T y
C (0,48 y 0,52, respectivamente) y de los genotipos TT, CT y CC
(0,24; 0,48 y 0,28, respectivamente) en ganado Holstein, donde
al alelo C fue el más frecuente [55].
Finalmente, las frecuencias alélicas y genotípicas en el SNP
rs29004508 (TABLA IV), muestran que el alelo C resultó el más
frecuente (0,94) comparado al alelo T (0,06). El genotipo CC
se presentó en la mayoría de los animales, en contraste con
el genotipo CT, mientras que el genotipo TT no fue detectado.
Este patrón es similar al encontrado en vacas Holstein iraníes,
con frecuencias de 0,782 y 0,218 para los alelos C y T,
TABLA IV
FRECUENCIAS ALÉLICAS Y GENOTÍPICAS DE LOS
POLIMORFISMOS DEL GEN LEP EN TOROS
DE RAZA CARORA
Polimorsmo F r e c u e n c i a s
alélicas
Frecuencias
genotípicas
rs29004487
A (84) 0,98 AA (41) 0,95
T (2) 0,02 TT (2) 0,05
rs29004501
C (69)
T (17)
0,8
0,2
CC (29) 0,67
CT (11) 0,26
TT (3) 0,07
rs29004488
T (51)
C (35)
0,59
0,41
CC (6) 0,14
CT (23) 0,53
TT (14) 0,33
rs29004508
C (79) 0,94 CC (37) 0,88
T (5) 0,06 CT (5) 0,12
89
Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXX, N° 2, 82 - 93, 2020
respectivamente, así como de 0,588 y 0,388 para los genotipos
CC y CT en el mismo orden [59], sin embargo, se destaca que
estos investigadores detectaron el genotipo TT (0,024), que
no fue evidenciado en el presente estudio. De igual forma, en
ganado Nelore se han reportado frecuencias alélicas de 0,99 y
0,01 para los alelos C y T, respectivamente, así como frecuencias
genotípicas de 0,998 y 0,02 para CC y CT en el mismo orden, sin
la detección del genotipo TT [15], esto es similar a lo presentado
en este estudio. Por otra parte, Ardicli y col. trabajando con toros
Holstein turcos, reportaron frecuencias de 0,147; 0,202 y 0,650
para los genotipos CC, CT y TT, respectivamente, donde destaca
la presencia del genotipo TT [2]. Adicionalmente, en vacas
Holstein eslovacas se determinaron frecuencias de 0,69 y 0,31
para los alelos C y T, respectivamente y 0,48; 0,43 y 0,09 para los
genotipos CC, CT y TT [55].
En este trabajo no se observó el genotipo TT en los SNP
rs29004487 y rs29004508, esto puede explicarse por el número
reducido de animales utilizado como unidades experimentales y
la baja frecuencia del alelo T para ambos SNP, aunque esto último
es un hallazgo similar a reportes previos en otras poblaciones
bovinas [18, 32, 59].
Estudios anteriores han demostrado la asociación entre los
polimorsmos del gen LEP y algunos rasgos de importancia
económica en el ganado bovino, como producción láctea,
producción de carne, crecimiento y rasgos reproductivos. En el
caso de la producción láctea, se ha reportado que el alelo T de
rs29004488, el alelo C de rs29004501 y el alelo C de rs29004508
se encuentran asociados con el incremento del rendimiento
lechero en ganado Holstein y Negro-Blanco polaco [7, 31, 54],
así como con el contenido de grasa, proteína, lactosa y punto de
congelación de la leche en ganado Jersey y Holstein [6, 8, 38].
En cuanto a la producción de carne, se ha reportado que
los SNP rs29004487 y rs29004488 se encuentran asociados
con características de rendimiento magro y de la grasa en la
canal bovina. El alelo T de rs29004488 ha sido asociado con
disminución del rendimiento magro y aumento de los depósitos,
así como del grado de la grasa de la canal bovina, explicando
aproximadamente el 4 % de la variación fenotípica de este rasgo
[52]. Por otra parte, en este mismo trabajo [52], se reportó que
el alelo T de rs29004487 se encuentra asociado con un alto
rendimiento magro y bajo contenido graso de la canal. De igual
forma, se destacó la baja frecuencia de este alelo, reportando
que la variación fenotípica asociada a este SNP, aumenta en
la medida que se incrementa la frecuencia del mismo [52]. En
cuanto a los rasgos de calidad y contenido de ácidos grasos
de la canal, se ha mencionado que los mismos se encuentran
asociados a los genotipos AA de rs29004487, CC de rs29004488
y CC de rs29004508, en ganado negro japonés [27].
En el aspecto reproductivo se ha reportado que algunos
polimorsmos del gen LEP pueden afectar el intervalo parto –
primer servicio y la edad al primer servicio en vacas Holstein [24],
así como características seminales en el búfalo (Bubalus bubalis)
y en el hombre [37, 45].
Esta investigación constituye un primer abordaje para la
caracterización del gen LEP en ganado Carora y permitirá
considerar el potencial genético de la raza para la producción
de leche o de carne, con características de valor añadido como
grasa en leche o ácidos grasos de la canal, así como algunos
rasgos reproductivos. Los alelos y genotipos identicados como
favorables en los estudios previos mencionados, se presentan
en frecuencias muy similares a las encontradas en la muestra de
toros Carora y constituye una oportunidad para el desarrollo de
estudios de asociación de rasgos productivos de importancia, con
polimorsmos del gen LEP. De comprobarse estas relaciones,
los hallazgos pueden ser utilizados en metodologías de selección
asistida por marcadores que complementen el programa de
mejoramiento genético de la raza.
Índices genéticos
Los rebaños Carora han sido sometidos a un intenso proceso
de selección para el incremento de la producción lechera en
términos de cantidad y calidad [11], de acuerdo a Attia y col. [4],
el tamaño reducido de la población y los procesos de selección,
pueden promover el desequilibrio genético en una población.
No obstante, la prueba del equilibrio de Hardy-Weinberg
(HW) mostrada en la TABLA V evidencia que el programa de
mejoramiento genético de la raza no ha afectado el equilibrio de
HW.
Sin embargo, los valores de heterocigosidad observada en
los SNP rs29004487, rs29004501 y rs29004508, se encuentran
por debajo de 0,5 (50 %). El cálculo de la heterocigosidad es
una de las maneras más precisas para medir la diversidad
genética de la población [44] y obtener una visión general de la
variabilidad genética [36]. Así mismo, se ha sugerido que valores
de heterocigosidad por debajo de 0,5 indican una variación
baja del gen en la población [23]. De igual forma, el índice de
diversidad genética de Nei muestra valores por debajo de 0,5.
Se ha mencionado que la diversidad es máxima cuando este
índice presenta valores cercanos a 1, y mínima cuando se
acerca a 0 [48]. La muestra de toros Carora estudiada constituye
una base genética de bajo número que ha sido sometida a un
intenso proceso de selección para la producción lechera, e
indirectamente para fertilidad y calidad seminal. Lo anterior
puede haber ocasionado valores de heterocigosidad por debajo
de 0,5 para estos alelos en la población.
En cuanto al índice de jación o coeciente de endogamia, se
ha mencionado que constituye una medida de la desviación de
las frecuencias genotípicas en términos de exceso o deciencia
de heterocigotos [58]. El valor de este índice varía entre -1 y 1; los
valores negativos indican un exceso de heterocigotos respecto al
equilibrio de HW. Los resultados obtenidos, permiten armar que
no existe endogamia en la muestra de toros Carora bajo estudio
(TABLA V); al mismo tiempo, los valores negativos muestran que
no existe deciencia de individuos heterocigotos para los SNP
rs29004487, rs29004488 y rs29004508, mientras que para el
SNP rs29004501, se observa un décit no signicativo, lo que
corrobora la existencia de equilibrio de HW en la población
estudiada, mencionada anteriormente.
Los resultados de la presente investigación muestran la
existencia de desequilibrio de ligamiento entre la mayoría de los
SNP (TABLA V). El DL se dene como un patrón de asociación
estadística no aleatoria entre alelos de diferentes loci de un
cromosoma, en una población, que ocasiona la segregación en
90
Caracterización de polimorsmos / Salazar; S. y col.
conjunto de los mismos [41], o en bloques de haplotipos que
resultan en combinaciones especícas de variantes alélicas que
se transmiten en conjunto a la descendencia [4]. El coeciente D’
puede alcanzar valores entre 0 y 1, mientras mayor sea el valor,
mayor será el grado de ligamiento entre las variantes alélicas.
De igual forma, los valores del coeciente r, pueden ubicarse en
el rango de 0 y 1, con el mismo signicado del coeciente D’.
En este estudio es evidente la existencia de un alto grado de
asociación entre el par rs29004487 - rs29004488, con un valor
de D’ cercano a 1; la misma situación ocurre entre los pares
rs29004487 - rs29004501 y rs29004487 – rs29004508. Esto
sugiere que estos SNP segregaran de forma conjunta en la
mayoría de los casos. Sin embargo, el coeciente de correlación
(r) es bajo, lo cual indica que no se encuentran completamente
ligados. Esto diere a lo establecido en trabajos previos [7], y
signica que no se puede inferir el genotipo del conjunto de
polimorsmos a partir de la genotipicación de uno de los SNP
de este grupo. A excepción del par rs29004488 – rs29004501, las
asociaciones detectadas en la presente investigación resultaron
no signicativas.
CONCLUSIONES
Las frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorsmos
rs29004487, rs29004488, rs29004501 y rs29004508 en la
población de toros de raza Carora estudiada, son similares a las
obtenidas en otros individuos Bos taurus.
No se detectó el genotipo TT en los SNP rs29004487 y
rs29004508, hallazgo similar a reportes previos en otras
poblaciones bovinas.
La evaluación del Equilibrio H-W indicó la existencia de
equilibrio en la población, así como de estabilidad génica.
La heterocigosidad observada, mostró la presencia de una
TABLA V
PARÁMETROS GENÉTICOS DE LA POBLACIÓN DE TOROS CARORA ESTUDIADA
Equilibrio de Hardy–Weinberg (HW), Heterocigosidad observada (H
o
) e Índice de Diversidad Genética de Nei
Polimorsmo HW (P- value) H
o
Nei
rs29004487 0,012 (0,913) 0,047 0,045
rs29004488 0,4 (0,527) 0,535 0,483
rs29004501 1,864 (0,172) 0,256 0,317
rs29004508 0,133 (0,715) 0,119 0,112
Índice de Fijación
Alelos / Locus rs29004487 rs29004488 rs29004501 rs29004508
A -0,024
C -0,108 0,194 -0,063
T -0,024 -0,108 0,194 -0,063
Total -0,024 -0,108 0,194 -0,063
Desequilibrio de ligamiento
Polimorsmos rs29004488 rs29004501 rs29004508
rs29004487
D 0,014 -0,005 -0,001
D’ 0,995 0,985 0,948
r 0,188 -0.078 -0,037
P 0,084 0,478 0,733
rs29004488
D -0,05 -0,003
D’ 0,606 0,115
r -0,252 -0,024
P 0,021 0,827
rs29004501
D -0,012
D’ 0,994
r -0,126
P 0,248
D: coeciente de desequilibrio de ligamiento; D’: coeciente de desequilibrio de ligamiento estandarizado; r: coeciente de correlación;
P: valor de probabilidad (P<0,05)
91
Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXX, N° 2, 82 - 93, 2020
moderada diversidad en los SNP rs29004488/ rs29004501, y así
mismo una baja diversidad en los SNP rs29004487/ rs29004508.
El índice de jación mostró un bajo nivel de consanguinidad en
la población de toros de raza Carora estudiada.
El estudio demostró la existencia de desequilibrio de ligamiento
entre la mayoría de los SNP evaluados. No obstante, no se
encuentran completamente ligados.
El gran potencial de la raza Carora como recurso zoogenético
tropical, fue conrmado a nivel genético molecular. Las
frecuencias de los alelos y genotipos evaluados podrían conrmar
que estos animales pueden ser utilizados en sistemas lecheros
intensivos, así como de doble propósito. No obstante, se requiere
incrementar la base muestral con el n de realizar una estimación
más exacta de las frecuencias alélicas y genotípicas de estos
polimorsmos en la raza Carora.
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Inseminación Articial Carora (CIAC) y al programa
de Estímulo a la Investigación e Innovación (PEII), Proyecto N°
201200674: “Caracterización de las variantes alélicas de genes
candidatos implicados en el control de la actividad reproductiva
de toros de raza Carora, con nes de selección y mejoramiento
genético”.
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2 2020
Esta revista fue editada en formato digital y publicada en
Diciembre 2020, por La Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela.
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