Created by pdf2htmlEX (https://github.com/coolwanglu/pdf2htmlex)HTML: <meta http-equiv="X-UA-Compatible" content="IE=edge,chrome=1">/* Copyright 2012 Mozilla Foundation Copyright 2013 Lu Wang <coolwanglu@gmail.com> Apache License Version 2.0 */ (function(){function b(a,b,e,f){var c=(a.className||"").split(/\s+/g);""===c[0]&&c.shift();var d=c.indexOf(b);0>d&&e&&c.push(b);0<=d&&f&&c.splice(d,1);a.className=c.join(" ");return 0<=d}if(!("classList"in document.createElement("div"))){var e={add:function(a){b(this.element,a,!0,!1)},contains:function(a){return b(this.element,a,!1,!1)},remove:function(a){b(this.element,a,!1,!0)},toggle:function(a){b(this.element,a,!0,!0)}};Object.defineProperty(HTMLElement.prototype,"classList",{get:function(){if(this._classList)return this._classList; var a=Object.create(e,{element:{value:this,writable:!1,enumerable:!0}});Object.defineProperty(this,"_classList",{value:a,writable:!1,enumerable:!1});return a},enumerable:!0})}})();(function(){/* pdf2htmlEX.js: Core UI functions for pdf2htmlEX Copyright 2012,2013 Lu Wang <coolwanglu@gmail.com> and other contributors https://github.com/coolwanglu/pdf2htmlEX/blob/master/share/LICENSE */ var q=window.pdf2htmlEX=window.pdf2htmlEX||{},r="pc",s="pi",t={container_id:"page-container",sidebar_id:"sidebar",outline_id:"outline",loading_indicator_cls:"loading-indicator",preload_pages:3,render_timeout:100,scale_step:0.9,key_handler:!0,hashchange_handler:!0,__dummy__:"no comma"};function v(a,b){return[a[0]*b[0]+a[2]*b[1]+a[4],a[1]*b[0]+a[3]*b[1]+a[5]]}function w(a){for(var b=0,c=a.length;b<c;++b)a[b].addEventListener("dragstart",function(){return!1},!1)} function x(a){for(var b={},c=0,d=arguments.length;c<d;++c){var e=arguments[c],g;for(g in e)e.hasOwnProperty(g)&&(b[g]=e[g])}return b} function y(a){if(a){this.g=this.loaded=!1;this.page=a;this.r=parseInt(a.getAttribute("data-page-no"),16);this.m=a.clientHeight;this.t=a.clientWidth;var b=a.getElementsByClassName(r)[0];b&&(this.h=b,this.s=this.f=this.m/b.clientHeight,this.u=JSON.parse(a.getElementsByClassName(s)[0].getAttribute("data-data")),a=this.k=this.u.ctm,b=a[0]*a[3]-a[1]*a[2],this.o=[a[3]/b,-a[1]/b,-a[2]/b,a[0]/b,(a[2]*a[5]-a[3]*a[4])/b,(a[1]*a[4]-a[0]*a[5])/b],this.loaded=!0)}} y.prototype={show:function(){this.loaded&&!this.g&&(this.h.classList.add("opened"),this.g=!0)},d:function(a){this.f=0===a?this.s:a;this.loaded&&(a=this.h.style,a.msTransform=a.webkitTransform=a.transform="scale("+this.f.toFixed(3)+")");a=this.page.style;a.height=this.m*this.f+"px";a.width=this.t*this.f+"px"},height:function(){return this.page.clientHeight},width:function(){return this.page.clientWidth}}; 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Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. ISSN 2477-9407 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Recibido el 05-04-2020 . Aceptado el 15-06-2020. *Autor de correspondencia. Correo electrónico: lhernandez@cibnor.mx Efectividad del extracto etanólico de Lippia palmeri Wats para el manejo de Fusarium spp. en semillas de garbanzo Effectiveness of ethanolic extract of Lippia palmeri Wats for the management of Fusarium spp. in chickpea seeds Efetividade do extrato etanólico de Lippia palmeri Wats no manejo de Fusarium spp. em sementes de grão de bico Mirella Romero-Bastidas 1 , Juan Jose Reyes-Perez 2 , Esli Alexis Mayer-Felix 1 , José Saúl Hernandez-Rubio 1 , Pablo Misael Arce-Amezquita 1 , Luis Guillermo Hernandez- Montiel 3* 1 Departamento Académico de Agronomía, Universidad Autónoma de Baja California Sur. Carretera al sur km 5.5, Col. El Mezquitito. 23080, La Paz, Baja California Sur. México. Correo electrónico: (MR) miromero@uabcs. mx, ; (EM) eslimayer@gmail.com, ; (JH) saulhr@gmail.com ; (PA) parce@uabcs.mx, . 2 Universidad Técnica Estatal de Quevedo. Av. Quito, Km 1,5 vía a Santo Domingo, Quevedo, Los Ríos, Ecuador. Correo electrónico: jreyes@uteq.edu.ec, . 3 Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste. Calle Instituto Politécnico Nacional 195. Col. Playa Palo de Santa Rita Sur. 23096, La Paz, Baja California Sur, México. Correo electrónico: lhernandez@cibnor.mx, . Resumen El garbanzo es un cultivo de importancia mundial debido a su valor nutricional, sin embargo, la cosecha se ve afectada por enfermedades en semillas y raíz ocasionadas por Fusarium spp., y para su control se aplican fungicidas sintéticos, por lo que los productos naturales basados en extractos de plantas pueden ser una opción para el manejo sustentable de enfermedades de este cultivo. El objetivo de esta investigación fue determinar la eciencia in vitro e in vivo del extracto etanólico de Lippia palmeri para el control de Fusarium oxysporum y F. solani en semillas de garbanzo. Al medio PDA se le añadió 500, 1000 y 2000 ppm del extracto etanólico de L. palmeri más un disco de agar de cada patógeno y se midió la inhibición del crecimiento micelial. Semillas de garbanzo fueron sumergidas DOI: https://doi.org/10.47280/RevFacAgron(LUZ).v37.n4.03 369 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 en cada concentración de L. palmeri por cinco y 10 min, posteriormente, cada semilla se inoculó con F. oxysporum y F. solani y se determinó la incidencia de la enfermedad y el número de semillas germinadas. Las tres concentraciones de L. palmeri inhibieron in vitro a ambos patógenos. En las semillas, el extracto etanólico de L. palmeri disminuyó la incidencia de F. solani y mantuvo por encima del 80 % la germinación. Para F. oxysporum solo la dosis más alta del extracto etanólico y el mayor tiempo de exposición disminuyó 20 % la incidencia y la germinación fue menor de 25 %. El extracto etanólico de L. palmeri puede ser una opción para disminuir enfermedades ocasionas por hongos topatógenos del suelo en semillas de garbanzo Palabras clave: antifúngicos, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, germinación. Abstract Chickpea is a crop of world importance due to its nutritional value; however, seed and root diseases caused by Fusarium spp. affect the harvest and for its control, synthetic fungicides are applied; nevertheless, natural products based on plant extracts may be an option for the sustainable management of this crop diseases. The objective of this research was to determine the in vitro and in vivo efciency of the Lippia palmeri extract for the control of Fusarium oxysporum and F. solani in chickpea seeds. To PDA media, 500, 1000 and 2000 ppm from ethanolic extract of L. palmeri plus one agar disc of each pathogen, and the inhibition of mycelial growth was quantied. Chickpea seeds were submerged in each concentration of L. palmeri for 5 and 10 min, later, each seed was inoculated with F. oxysporum and F. solani and the disease incidence and germinated seeds were determined. The three concentrations of L. palmeri inhibited both phytopathogens in vitro. In the seeds, L. palmeri ethanolic extract decreased the incidence of F. solani and kept germination above 80 %. For F.oxysporum only the highest dose of the ethanolic extract and the longest exposure time decreased the incidence by 20 % and germination was less than 25 %.The ethanolic extract of L. palmeri can be an option to decrease diseases caused by phytopathogenic fungus of the soil in chickpea seeds. Key words: antifungal, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, germination. Resumo O grão-de-bico é uma cultura de importância global devido ao seu valor nutricional; no entanto, a cultura é afetada por doenças de sementes e raízes causadas por Fusarium spp. E são aplicados fungicidas sintéticos para controlá- lo, portanto, produtos naturais à base de nos extratos vegetais, podem ser uma opção para o manejo sustentável das doenças dessa cultura. O objetivo desta investigação foi determinar a eciência in vitro e in vivo do extrato etanólico de Lippia palmeri para o controle de Fusarium oxysporum e F. solani em sementes 370 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 de grão de bico. Ao meio PDA, 500, 1000 e 2000 ppm do extrato etanólico de L. palmeri mais um disco de ágar de cada patógeno foram adicionados e a inibição do crescimento micelial foi medida. Sementes de grão-de-bico foram imersas em cada concentração de L. palmeri por cinco e 10 minutos e, posteriormente, cada semente foi inoculada com F. oxysporum e F. solani, determinando-se a incidência da doença e o número de sementes germinadas. As três concentrações de L. palmeri inibiram ambos os patógenos in vitro. Nas sementes, o extrato etanólico de L. palmeri diminuiu a incidência de F. solani e manteve a germinação acima de 80 %. Para F. oxysporum, apenas a dose mais alta do extrato etanólico e o maior tempo de exposição diminuíram a incidência em 20 % e a germinação foi menor que 25 %. O extrato etanólico de L. palmeri pode ser uma opção para reduzir doenças causadas por fungos topatogênicos do solo em sementes de grão de bico Palavras-chave: antifúngicos, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, germinação. Introducción La demanda constante de agro- productos libres de plaguicidas sintéticos ha obligado a implementar alternativas de producción, libres de residuos químicos dentro de los sistemas agrícolas (Sayuri et al., 2018). Sin embargo, el control de hongos topatógenos sin el uso tradicional de plaguicidas sintéticos ha sido uno de los principales retos para el manejo sustentable de los cultivos. Actualmente, los productos naturales basados en extractos de plantas han generado un gran interés para el manejo de topatógenos, con la ventaja de que no presentan un impacto negativo al ambiente ni a la salud humana o animal (Shirazi et al., 2020). Entre los diferentes compuestos antifúngicos que contienen los extractos de plantas destacan los alcaloides, taninos, quinonas, cumarinas, compuestos fenólicos y toalexinas (Wangkhem et al., 2019), los cuales, han controlado Introduction The constant demand of agro- products free of synthetic pesticides has forced to implement production alternatives, free of chemical residues within agricultural systems (Sayuri et al., 2018). However, the control of phytopathogenic fungus without the traditional use of synthetic pesticides has been one of the main challenges for the sustainable management of crops. Nowadays, natural products based on plant extracts have generated a big interest for the management of phytopathogens, with the advantage that they do not have a negative impact on the environment or on human or animal health (Shirazi et al., 2020). Among the different antifungal compounds contained in plant extracts, there are: alkaloids, tannins, quinones, coumarins, phenolic compounds and phytoalexins (Wangkhem et al., 2019), which have controlled efciently to various phytopathogenic fungus 371 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 de manera eciente a diversos hongos topatógenos como; Botrytis cinerea (Şesan et al., 2015), Colletotrichum spp. (Melo et al., 2016), Fusarium spp. (Wang et al., 2016), Phytophthora capsici (Tala et al., 2018), entre otros. El orégano (Lippia palmeri Wats) de la familia Verbenaceae, ha sido usado tradicionalmente en la medicina popular para disminuir problemas respiratorios, digestivos, dolores de cabeza, reumatismo, entre otros (Leyva-López et al., 2016). Además, se han estudiado sus propiedades farmacológicas (Gutiérrez-Grijalva et al., 2019), antioxidantes (Gutiérrez‐Grijalva et al., 2019) y antimicrobianas (Ortega-Nieblas et al., 2011). De la gama de compuestos químicos que presenta L. palmeri, destacan el carvacrol, timol, eugenol y cimeno, debido a su alta acción antimicrobiana, causando principalmente disrupción de las membranas y paredes celulares de los microorganismos (Oyedemi et al., 2009; Tornuk et al., 2014). El extracto etanólico de L. palmeri ha sido eciente para el control de diversos patógenos de humanos como Escherichia coli y Staphylococcus aureus (Ortega-Nieblas et al., 2011) y topatógenos como &ODYLEDFWHUmichiganensissubespecie michiganensis (Borboa-Flores et al., 2010). Hasta ahora, según concierne a los autores de este trabajo, no existen reportes de su aplicación para el control de hongos de raíz, los cuales, son uno de los topatógenos más comunes y severos de diversos cultivos. El garbanzo (Cicer arietinum L.), es un cultivo que se destaca por su alto valor nutricional, sin embargo, la cosecha se ve disminuida por diversos such as; Botrytis cinerea (Şesan et al.,2015), Colletotrichum spp. (Melo et al.,2016), Fusarium spp. (Wang et al.,2016), Phytophthora capsici (Tala et al.,2018), among others. The oregano (Lippia palmeri Wats) of the Verbenaceae family, has been traditionally used in popular medicine to decrease respiratory and digestive problems, headaches, rheumatism, among others (Leyva-López et al., 2016). In addition, its pharmacological (Gutiérrez-Grijalva et al., 2019), antioxidants (Gutiérrez-Grijalva et al., 2019) and antimicrobials (Ortega- Nieblas et al., 2011) properties have been studied. From the range of chemical compounds that L. palmeri presents, there are the carvacrol, thymol, eugenol and cymene, due to its high antimicrobial action, mainly causing disruption of the membranes and cell walls of microorganisms (Oyedemi et al., 2009; Tornuk et al., 2014). The ethanolic extract of L. palmeri has been efcient for the control of various human pathogens such as Escherichiacoli and Staphylococcus aureus (Ortega-Nieblas et al., 2011) and phytopathogens such as Clavibacter michiganensis subspecie michiganensis (Borboa- Flores et al., 2010). Until now, according to the authors of this work, there are no reports of its application for the control of root fungus, which are one of the most common and severe phytopathogens of various crops. The chickpea (Cicer arietinum L.), is a crop that stands out for its high nutritional value, however, the harvest is diminished by various factors, 372 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 factores, destacando las enfermedades ocasionadas por diversos hongos topatógenos (Sankar et al., 2019). Fusarium oxysporum y F. solani son dos hongos que causan enfermedades en semillas y raíz de plantas de garbanzo y están considerados como topatógenos de importancia debido a su amplia distribución mundial y a las pérdidas que producen anualmente, dentro de los principales síntomas que ocasionan están las pudriciones y/o necrosis en la semilla o pudrición y/o necrosis de raíz y marchitamiento general que provocan la muerte de las plantas en vivero o campo (Sunkad et al., 2019). En México, la variedad de garbanzo Blanco Sinaloa genera un grano con mayor demanda del mercado internacional, no obstante, ha mostrado susceptibilidad a las enfermedades de raíz (Frac et al., 2016), por lo que el uso del extracto etanólico de L. palmeri pudiera ser una alternativa para el control de hongos topatógenos en esta especie. El objetivo del presente estudio fue evaluar la eciencia in vitro e in vivo del extracto etanólico de L. palmeri para el control de F. oxysporum y F. solani en semillas de garbanzo. Materiales y métodos Obtención de la semilla Se utilizaron semillas de garbanzo de la variedad Blanco Sinaloa (INIFAP, Ortega-Murrieta et al., 2016), donada por productores de la región agrícola “Valle de Santo Domingo” ubicada en Ciudad Constitución, Baja California Sur, México (25°01′56″ N, 111°40′13″ O). highlighting the diseases caused by various phytopathogenic fungus (Sankar et al., 2019). F. oxysporum and F. Solani are two fungus that cause diseases in seeds and roots of chickpea plants and they are considered phytopathogens of importance due to their wide global distribution and the losses that they produce annually, among the main symptoms that they cause there are rots and / or necrosis in the seed or rot and / or root necrosis and general withering that causes the death of plants in seedling center or eld (Sunkad et al., 2019). In Mexico, the Blanco Sinaloa chickpea variety generates a grain with higher demand in the international market, however, it has shown susceptibility to root diseases (Frac et al., 2016), so the use of L. palmeri ethanolic extract could be an alternative for the control of phytopathogenic fungus in this specie. The objective of the present research was to evaluate the in vitro and in vivo efciency of L. palmeri ethanolic extract for the control of F. oxysporum and F. solani in chickpea seeds. Materials and methods Seeds collection Chickpea seeds of Blanco Sinaloa variety were used (INIFAP, Ortega- Murrieta et al., 2016), donated by producers from the “Valle de Santo Domingo” agricultural region located in Ciudad Constitución, Baja California Sur, Mexico (25° 01′56″ N, 111°40′13″ O). 373 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 Hongos topatógenos Los aislamientos de F. oxysporum y F. solani fueron suministrados por el Laboratorio de Fitopatología del Departamento Académico de Agronomía, Universidad Autónoma de Baja California Sur. F. oxysporum y F. solani, fueron reactivados en placas Petri con el medio de cultivo papa- dextrosa-agar (PDA) y se incubaron a 28 °C por siete días. Prueba de patogenicidad Para determinar la patogenicidad de F. oxysporum y F. solani se utilizaron semillas de garbanzo previamente esterilizadas con una solución de NaClO al 1 % m / v durante dos min, posteriormente, se lavaron con agua destilada estéril y se dejaron secar por 30 min. La concentración de cada topatógeno se ajustó a 1 × 10 4 esporas.mL -1 utilizando un hematocitómetro y cada semilla fue inoculada con 20 µL de cada una de las suspensiones conidiales de F. oxysporum y F. solani. Se utilizó un lote de semillas sin topatógeno como grupo control. Las semillas se incubaron en una cámara ambiental a 28 ± 2 °C y 12 h de luz/oscuridad por siete días. La incidencia de la enfermedad (%) fue determinada en semillas con presencia de micelio y síntomas de pudriciones ocasionadas por los hongos, los cuales, fueron re- aislados en PDA para comprobar los postulados de Koch. Se utilizaron 30 semillas por tratamiento y el experimento fue realizado dos veces. Material vegetal y preparación de extractos etanólicos de L. palmeri Se colectaron plantas silvestres de Lippia palmeri en La Paz, Baja Phytopathogenic fungus The isolations of F. oxysporum and F. Solani were provided by the Laboratorio de Fitopatología del Departamento Académico de Agronomía, Universidad Autónoma de Baja California Sur. F. oxysporum and F. solani, were reactivated in Petri dishes with the potato-dextrose-agar (PDA) culture media and incubated at 28° C for seven days. Pathogenicity test To determine the pathogenicity of F. oxysporum and F. solani, chickpea seeds previously sterilized with a solution of NaClO at 1 % m / v during 2 min were used, later, they were washed with sterile distilled water and left to dry for 30 min. The concentration of each phytopathogen was adjusted to 1 × 10 4 spores. mL -1 using a hematocytometer and each seed was inoculated with 20 µL of each of the F. oxysporum and F. solani conidial suspensions. A batch of seeds without phytopathogen was used as a control group. The seeds were incubated in an environmental chamber at 28 ± 2 °C and 12 h of light/darkness for seven days. The incidence of the disease (%) was determined in seeds with the presence of mycelium and symptoms of rot caused by fungus, which were re-isolated in PDA to verify Koch’s postulates. Thirty seeds were used per treatment and the experiment was carried out twice. Plant material and preparation of L. palmeri ethanolic extracts Wild plants were collected from Lippia palmeri in La Paz, Baja California Sur, Mexico (24°08′32 ″ N, 110°18′39 ″ W). To obtain the ethanolic 374 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 California Sur, México (24°08′32″ N, 110°18′39″ O). Para obtener el extracto etanólico (EE), las plantas se secaron a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) por siete días. Posteriormente, el material seco se trituró y se depositaron 300 g en recipientes de vidrio de 1 L, conteniendo 900 mL de etanol al 96 % v / v . Los recipientes fueron sellados y almacenados por siete días a 25 °C en completa oscuridad. El macerado en etanol fue ltrado a través de papel de ltro Wathman No. 4 y el etanol fue evaporado en un evaporador rotativo (Buchi B-480) a 40 °C, hasta sequedad completa. El extracto etanólico de L. palmeri se mantuvo a temperatura de -4 °C, hasta su uso. Evaluación in vitro de la actividad antifúngica del extracto etanólico de L. palmeri El efecto del extracto etanólico de L. palmeri sobre la inhibición del crecimiento micelial de F. oxysporum y F. solani fue evaluado mediante el método de difusión en agar propuesto por Soylu et al. (2007). El volumen de PDA necesario para dispensar 15 mL/placa Petri fue preparado y esterilizado, una vez alcanzada la temperatura de 40 °C, se le agregó el volumen del extracto etanólico necesario para obtener las concentraciones de 500, 1000 y 2000 ppm, posteriormente, se colocó en el centro de las placas un disco de 0,5 cm de diámetro proveniente de un cultivo en PDA de siete días de cada topatógeno. Un grupo de placas con PDA fueron mezcladas con el fungicida sintético Captan (1 % N-triclorometiltio-4- ciclohexano-1,2-dicarboximida) a una dosis de 0,2 mg.mL -1 e inoculadas extract (EE), the plants were dried at room temperature (25 ± 2 °C) for seven days. After, the dry material was crushed and 300 g were deposited in 1 L glass containers, containing 900 mL of 96 % v / v ethanol. The containers were sealed and stored for seven days at 25 ° C in complete darkness. The macerated in ethanol was ltered through Wathman No.4 lter paper and the ethanol was evaporated on a rotary evaporator (Buchi B-480) at 40 °C, until complete dryness. The ethanolic extract of L. palmeri was kept at a temperature of -4 °C, until its use. In vitro evaluation of the antifungal activity of L. palmeri ethanolic extract The effect of L. palmeri ethanolic extract on the inhibition of mycelial growth of F. oxysporum and F. solani was evaluated using the diffusion method in agar proposed by Soylu et al. (2007). The volume of PDA necessary to dispense 15 mL/Petri dish was prepared and sterilized, once the temperature of 40 °C was reach, the volume of the ethanolic extract necessary to obtain the concentrations of 500, 1000 and 2000 ppm was added, later, in the center of the plates a 0.5 cm diameter disc from the culture in PDA of each pathogen was placed. A group of plates with PDA were mixed with the Captan synthetic fungicide (1 % N-trichloromethylthio- 4-cyclohexane-1.2 -dicarboximide) at a dose of 0.2 mg.mL -1 and inoculated with each phytopathogen. As control treatment, PDA with ethanol at 96 % v / v and phytopathogen were mixed. The plates were incubated at 28 °C for 10 days. Ten replicates per 375 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 con cada topatógeno. Como tratamiento control se mezcló PDA con etanol al 96 % v / v y topatógeno. Las placas fueron incubadas a 28 ºC por 10 días. Se utilizaron diez réplicas por tratamiento. Al nal del experimento, se midió el diámetro (mm) del crecimiento radial de cada topatógeno y se expresó en porcentaje (%) de inhibición mediante la fórmula propuesta por Daryaei et al. (2016): IM (%) = 100 × (C – R)/C Dónde: IM: Inhibición radial del topatógeno en porcentaje C = Diámetro de la colonia del tratamiento control R = Diámetro de la colonia del topatógeno de cada tratamiento Efecto del extracto etanólico de L. palmeri sobre la germinación y la pudrición de las semillas de garbanzo causada por F. oxysporum y F. solani Se utilizaron semillas de garbanzo previamente esterilizadas con una de solución de NaClO al 1 % m / v por dos min, posteriormente, se lavaron con agua destilada estéril y se dejaron secar por 30 min. Lotes de semillas fueron embebidos en tres concentraciones (500, 1000 y 2000 ppm) del extracto etanólico de L. palmeri por cinco y 10 min. Seguidamente, cada semilla fue inoculada con 20 µL de cada suspensión conidial (previamente ajustada a 1 × 10 4 esporas.mL -1 ) de F. oxysporum y F. solani. Lotes de semillas fueron inoculados con cada topatógeno y el fungicida sintético Captan (1 % de N-triclorometiltio-4- ciclohexano-1,2-dicarboximida) a una treatment were used. At the end of the experiment, the diameter (mm) of the radial growth of each phytopathogen was measured and it was expressed as a percentage (%) of inhibition by the formula proposed by Daryaei et al. (2016): IM (%) = 100 × (C – R)/C Where: IM: Radial inhibition of the phytopathogen in percentage C = Diameter of the colony of the control treatment R = Diameter of the phytopathogen colony of each treatment Effect of the ethanolic extract of L. palmeri on germination and rot of chickpea seeds caused by F. oxysporum and F. solani Chickpea seeds previously sterilized with a solution of NaClO at 1% m / v for 2 min were used, after, they were washed with sterile distilled water and they were left to dry for 30 min. Seed lots were submerged in three concentrations (500, 1000 and 2000 ppm) of L. palmeri ethanolic extract for 5 and 10 min. Then, each seed was inoculated with 20 µL of each conidial suspension (previously adjusted to 1 × 104 spores. mL -1 ) of F. oxysporum and F. solani. Seed lots were inoculated with each phytopathogen and the Captan synthetic fungicide (1 % N-trichloromethylthio-4-cyclohexane- 1.2-dicarboximide) at a dose of 0.2 mg.mL -1 , another with ethanol at 96 % v / v and one more with sterile distilled water (ADE). A batch of seeds without fungus was considered as a control. The seeds were incubated in an 376 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 dosis de 0,2 mg.mL -1 , otro con etanol al 96 % v / v y uno más con agua destilada estéril (ADE). Un lote de semillas sin hongos fue considerado como control. Las semillas se incubaron en una cámara ambiental a 28 ± 2 °C y 12 h de luz/oscuridad por siete (7) días. Se determinó el porcentaje de la incidencia de la enfermedad y el porcentaje de semillas germinadas. Se utilizaron 30 semillas por tratamiento y el experimento fue realizado dos veces. Diseño experimental y análisis estadístico Se empleó un diseño experimental completamente al azar y los datos fueron procesados por un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Se utilizó el paquete estadístico Statistica® v. 10,0 para Windows (StatSoft) y para la comparación de medias se utilizó la prueba de Tukey (p<0,05). Los porcentajes se transformaron con raíz cuadrada de arcoseno. Resultados y discusión Patogenicidad de F. oxysporum y F. solani Ambos hongos tuvieron una incidencia del 100 % sobre las semillas de garbanzo. A las 24 h después de inoculado F. solani, se observó sobre las semillas de garbanzo un crecimiento micelial de color blanco a beige, con textura afelpada o esponjosa y a los tres (3) días la radícula mostró síntomas asociados a clorosis de tejido, acidez y pudrición de la parte apical. En el caso de F. oxysporum, a las 24 h las semillas presentaron environmental chamber at 28 ± 2°C and 12 h of light/darkness for seven (7) days. The percentage of the incidence of the disease and the percentage of germinated seeds were determined. Thirty seeds per treatment were used and the experiment was carried out twice. Experimental design and statistical analysis A completely randomized experimental design was used and the data were processed by a one-way analysis of variance (ANOVA). The Statistica® v. 10.0 statistical package was used for Windows (StatSoft) and Tukey’s test (p<0.05) was used for the comparison of means. The percentages were transformed with arcsine square root. Results and discussion Pathogenicity of F. oxysporum and F. solani Both fungus had an incidence of 100 % on chickpea seeds. At 24 h after inoculating F. solani, a white to beige mycelial growth with spongy texture was observed on the chickpea seeds and at day three (3) the radicle showed symptoms associated with tissue chlorosis, accidity and rot of the apical part. In the case of F. oxysporum, at 24 h the seeds presented plush mycelial growth of white to purple coloration and at day ve (5) the radicle presented symptoms of tissue chlorosis. Re-isolation of both phytopathogens of chickpea seeds veried Koch’s postulates. Chickpea is a crop affected by more than 50 phytopathogens around the 377 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 crecimiento micelial afelpado de coloración blanco a purpura y a los cinco (5) días la radícula presentó síntomas de clorosis de tejido. El re- aislamiento de ambos topatógenos de las semillas de garbanzo comprobó los postulados de Koch. El garbanzo, es un cultivo afectado por más de 50 topatógenos alrededor del mundo (Nene et al., 1996; Sankar et al., 2018). Los hongos topatógenos, constituyen uno de los grupos de mayor importancia debido a las pérdidas que ocasionan en los cultivos. F. solani y F. oxysporum son dos topatógenos del suelo que afectan al garbanzo, ocasionando desde pudrición de semilla hasta la muerte de la planta, originando pérdidas económicas en todo el ciclo del cultivo (El Hazzat et al., 2019; Tlemsani et al., 2020). Además, el género Fusarium es considerado uno de los estresores bióticos para las plantas más importantes que presentan resistencia a los fungicidas sintéticos, complicando su control (Oliva-Ortiz et al., 2017). Por lo tanto, la búsqueda de alternativas para disminuir enfermedades en las plantas ocasionadas por hongos topatógenos es una prioridad a nivel mundial (Shuping y Eloff, 2017). Efecto del extracto etanólico de L. palmeri sobre el crecimiento micelial de F. oxysporum y F. solani Las tres concentraciones (500 ppm, 1000 ppm y 2000 ppm) del extracto etanólico de L. palmeri inhibieron signicativamente el crecimiento radial de F. solani y F. oxysporum en comparación al tratamiento control (gura 1). world (Nene et al., 1996; Sankar et al., 2018). The phytopathogenic fungus are one of the most important groups due to the losses they cause in crops. F. solani and F. oxysporum are two soil phytopathogens that affect chickpea, producing from seed rot to death of the plant, causing economic losses throughout the crop cycle (El Hazzat et al., 2019; Tlemsani et al., 2020). Also, the genus Fusarium is considered one of the biotic stressors for the most important plants that present resistance to synthetic fungicides, complicating their control (Oliva-Ortiz et al., 2017). Therefore, the search for alternatives to reduce plant diseases caused by phytopathogenic fungus is a worldwide priority (Shuping and Eloff, 2017). Effect of L. palmeri ethanolic extract on the mycelial growth of F oxysporum and F. solani The three concentrations (500 ppm, 1000 ppm, and 2000 ppm) of L. palmeri ethanolic extract signicantly inhibited the radial growth of F. solani and F. oxysporum in comparison to the control treatment (gure 1). In the case of F. oxysporum, the concentration of 2000 ppm of L. palmeri ethanolic extract, inhibited the phytopathogen by 100 % and for the case of F. solani, the concentrations of 1000 and 2000 ppm of this Fabaceae inhibited it by 100 %. With the Captan synthetic fungicide the inhibition of F. oxysporum was 79 % and for F. solani was 100%. The control (ethanol) had no inhibition effects on both phytopathogens (gure 2). Plant extracts have a broad antimicrobial activity towards various 378 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 En el caso de F. oxysporum, la concentración de 2000 ppm del extracto etanólico de L. palmeri, inhibió al topatógeno en un 100 % y para el caso de F. solani, las concentraciones de 1000 y 2000 ppm de esta Fabaceae, lo inhibieron un 100 %. Con el fungicida sintético Captan la inhibición de F. oxysporum fue del 79 % y para F. solani del 100 %. El control (etanol) no tuvo efectos de inhibición sobre ambos topatógenos (gura 2). Los extractos de plantas tienen una amplia actividad antimicrobiana hacia diversos topatógenos debido al contenido de sustancias activas como toalexinas y toantocianinas que contienen alcaloides, avónidos, terpenoides, fenoles, glucósidos, taninos y / o ácidos grasos (Andrade- Bustamante et al., 2018). Figura 1. Efecto in vitro del extracto etanólico de Lippia palmeri sobre la inhibición micelial de F. solani y F. oxysporum. Columnas con letras diferentes indican diferencias signicativas de acuerdo a la prueba de Tukey (p< 0,05). Figure 1. In vitro effect of ethanolic extract of Lippia palmeri extract on the mycelial inhibition of F. solani and F. oxysporum. Columns with different letters indicate signicant differences according to the Tukey test (p< 0.05). phytopathogens due to the content of active substances such as phytoalexins and phytoanthocyanins that contain alkaloids, avonides, terpenoids, phenols, glycosides, tannins and / or fatty acids (Andrade-Bustamante et al., 2018). The ethanolic extract of L. palmeri inhibited F. solani and F. oxysporum in vitro and in vivo, which could be mainly due to the content of aromatic monoterpenes such as carvacrol and thymol, and to alkylbenzenep- cymene, which have been reported as important antifungals. (Wang et al., 2018). Various studies show that these monoterpenes inhibit phytopathogenic fungus mainly due to the damage they cause to their membrane structure, inhibition of biosynthesis and nucleic acids function, interference of essential metabolic processes, induction of 379 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 El extracto etanólico de L. palmeri inhibió in vitro e in vivo a F. solani y F. oxysporum, lo cual pudiera deberse principalmente al contenido de monoterpenos aromáticos como el carvacrol y timol, y al alquibenceno p-cimeno, los cuales, han sido reportados como importantes antifúngicos (Wang et al., 2018). Diversos estudios demuestran que estos monoterpenos inhiben a los hongos topatógenos principalmente por el daño que ocasionan en la estructura de su membrana, inhibición de la biosíntesis y función de los ácidos nucleicos, interferencia de procesos metabólicos esenciales, inducción de la coagulación de los componentes citoplásmicos y la interrupción en la comunicación celular normal (Radulovic et al., 2013), inhibición de la fosforilación oxidativa de la membrana celular y de enzimas como la celulasa, pectinasa, lacasa, xilanasa, entre otras, causando una limitación en Figura 2. Efecto in vitro de tres concentraciones del extracto etanólico de Lippia palmeri sobre el crecimiento micelial de F. oxysporum y F. solani. Fungicida = Captan (0,2 mg.mL -1 ). Control = etanol al 96 % v /v. Figure 2. In vitro effect of three concentrations of ethanolic extract of Lippia palmeri on the mycelial growth of F. oxysporum and F. solani . Synthetic fungicide = Captan (0.2 mg.mL -1 ) Control = 96 % ethanol v /v. coagulation of cytoplasmic components and interruption in normal cellular communication (Radulovic et al., 2013), inhibition of oxidative phosphorylation of the cell membrane and of enzymes such as cellulase, pectinase, laccase, xylanase, among others, causing a limitation in the absorption of nutrients (complexation of metals and insolubilization of proteins) for the fungus (Lattanzio et al., 2006; Morales et al., 2017). Effect of L. palmeri ethanolic extract on germination and rot of chickpea seeds caused by F. solani and F. oxysporum The different doses of L. palmeri ethanolic extract signicantly decreased the incidence of F. solani and they kept germination of chickpea seeds over 80 % (gure 3). The application of 2000 ppm of L. palmeri ethanolic extract for 5 and 10 min in the seeds, signicantly reduced 380 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 la absorción de nutrientes (complejación de metales e insolubilización de proteínas) para el hongo (Lattanzio et al., 2006; Morales et al., 2017). Efecto del extracto etanólico de L. palmeri sobre la germinación y la pudrición de las semillas de garbanzo causada por F. solani y F. oxysporum Las distintas dosis del extracto etanólico de L. palmeri disminuyeron signicativamente la incidencia del F. solani y mantuvieron sobre el 80 % la germinación de las semillas de garbanzo (gura 3). the incidence of the phytopathogen by less than 26 %, surpassing the treatment with Captan synthetic fungicide. The seeds submerged in both times with 1000 ppm of the extract of L. palmeri, presented similar statistical values to the treatment with Captan. In treatments with ADE (sterile distilled water) and ethanol, the incidence of F. solani was higher than 82 %. No damaged seeds were observed in the control treatment. Regarding to the germination of the seeds, the control treatment presented more than 94%. The germination of Figura 3. Efecto del extracto etanólico de L. palmeri sobre la protección de semillas de garbanzo. A) Incidencia de F. solani. B) Porcentaje de semillas germinadas. Fungicida = Captan (0,2 mg.mL -1 ). ADE = agua destilada estéril. Etanol = etanol al 96 % v / v . Control = sin topatógeno. Columnas con letras diferentes indican diferencias signicativas de acuerdo a la prueba de Tukey (p<0,05). Figure 3. Effect of the ethanolic extract of L. palmeri on the protection of chickpea seeds. A) Incidence of F. solani. B) Percentage of sprouted seeds. Synthetic fungicide = Captan (0.2 mg.mL -1 ). ADE = sterile distilled water. Ethanol = 96 % ethanol v / v . Control = without phytopathogen. Columns with different letters indicate signicant differences according to the Tukey test (p<0.05). 381 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 La aplicación de 2000 ppm del extracto etanólico de L. palmeri por cinco y 10 min en las semillas, redujeron signicativamente en menos del 26 % la incidencia del topatógeno, superando al tratamiento con el fungicida sintético Captan. Las semillas embebidas en ambos tiempos con 1000 ppm del extracto de L. palmeri, presentaron valores estadísticos similares al tratamiento con Captan. En los tratamientos con ADE (agua destilada estéril) y etanol, la incidencia de F. solani fue superior de 82 %. No se observaron semillas dañadas en el tratamiento control. En relación a la germinación de las semillas, el tratamiento control presentó más del 94 %. La germinación de las semillas embebidas en 2000 ppm del extracto etanólico de L. palmeri por cinco y 10 min, presentaron valores del 70 y 80 %, respectivamente. Las semillas con 1000 ppm del extracto etanólico de L. palmeri, presentaron valores estadísticos de germinación similares al tratamiento con Captan. En los tratamientos con ADE (agua destilada estéril) y etanol, la germinación fue menor del 18 %. Con respecto a la germinación y la pudrición de las semillas de garbanzo causada por F. oxysporum solo la dosis más alta del extracto etanólico de L. palmeri, disminuyó signicativamente la incidencia del hongo cuando las semillas de garbanzo fueron embebidas por 10 min y la germinación fue del 25 % (gura 4). the seeds submerged in 2000 ppm of L. palmeri ethanolic extract for ve and 10 min, presented values of 70 and 80 %, respectively. The seeds with 1000 ppm of L. palmeri ethanolic extract, presented statistical values of germination similar to the treatment with Captan. In the treatments with ADE (sterile distilled water) and ethanol, the germination was less than 18 %. According to the germination and rot of chickpea seeds caused by F. oxysporum, only the highest dose of L. palmeri ethanolic extract signicantly decreased the incidence of the fungus when chickpea seeds were submerged for 10 min and germination was of 25 % (gure 4). The incidence of treatment only with F. oxysporum was higher than 80 % in the rest of the treatments, reducing seed germination by less than 6 %. In the treatments with ADE (sterile distilled water) and ethanol, no incidence of F. oxysporum was observed and the germination of the seeds was 95 %. The chickpea seeds submerged in L. palmeri ethanolic extract were protected towards F. solani, in addition to maintain a high level of germination, overcoming the effect of the Captan synthetic fungicide, due to plant extracts are an option to maintain the vigor and health of seeds, essential characteristics for the yield and quality of the crops (Sayuri et al. 2018). The L. palmeri ethanolic extract did not signicantly decrease the incidence of F. oxysporum, therefore a low germination of chickpea 382 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 La incidencia del tratamiento solo con F. oxysporum fue superior al 80 % en el resto de los tratamientos, disminuyendo la germinación de las semillas en menos del 6 %. En los tratamientos con ADE (agua seeds was quantied, however, the highest dose and the longest time of exposure of the seed to the extract decreased the presence of the phytopathogen so, it is necessary to evaluate in future works a longer Figura 4. Efecto del extracto etanólico de L. palmeri sobre la protección de semillas de garbanzo. A) Incidencia de F. oxysporum. B) Porcentaje de semillas germinadas. Fungicida = Captan (0,2 mg.mL -1 ). ADE = agua destilada estéril. Etanol = etanol al 96 % v / v . Control = Sin .topatógeno. Columnas con letras diferentes indican diferencias signi.cativas de acuerdo a la prueba de Tukey (p< 0,05). Figure 4. Effect of the ethanolic extract of L. palmeri on the protection of chickpea seeds. A) Incidence of F. oxysporum. B) Percentage of sprouted seeds. Synthetic fungicide = Captan (0.2 mg.mL -1 ). ADE = sterile distilled water. Ethanol = 96 % ethanol v / v . Control = without phytopathogen. Columns with different letters indicate signi.cant differences according to the Tukey test (p< 0,05). 383 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 End of English Version exposure time of the seed in higher doses of the L. palmeri ethanolic extract to achieve the control of this phytopathogen. In this regard, Onaran and Yanar (2016) and Iqbal et al. (2019), mention the importance of determining the plant inhibition dose in plant extracts to subsequently apply a dose that guarantees a better efciency for its control. The low efciency of the synthetic fungicide for the control of F. oxysporum in chickpea seeds is probably due to the resistance to the chemical groups of the fungicide, the virulence of the phytopathogen, host susceptibility, abiotic conditions, among others (Mengist et al., 2018). Conclusions The L. palmeri ethanolic extract reduced the radial growth of F. solani and F. oxysporum in vitro, and its application in chickpea seeds reduced the incidence of both phytopathogens. Plant extracts can be an efcient option in the management of phytopathogenic fungus associated with seeds, being an ecological and low cost solution. destilada estéril) y etanol, no se observó incidencia de F. oxysporum y la germinación de las semillas fue del 95 %. Las semillas de garbanzo embebidas en el extracto etanólico de L. palmeri fueron protegidas hacia F. solani, además de mantener un alto nivel de germinación superando al efecto del fungicida sintético Captan, por lo que los extractos de plantas son una opción para mantener el vigor y sanidad de las semillas, características indispensables para el rendimiento y calidad de los cultivos (Sayuri et al. 2018). El extracto etanólico de L. palmeri no disminuyó signicativamente la incidencia de F. oxysporum por lo tanto se cuanticó una baja germinación de las semillas de garbanzo, sin embargo, la dosis más alta y el mayor tiempo de exposición de la semilla al extracto disminuyó la presencia del topatógeno, por lo que es necesario evaluar en futuros trabajos un mayor tiempo de exposición de la semilla en dosis más altas del extracto etanólico de L. palmeri para lograr el control de este topatógeno. Al respecto Onaran y Yanar (2016) y Iqbal et al. (2019), mencionan la importancia de determinar en los extractos vegetales la dosis de inhibición por topatógeno para posteriormente aplicar una dosis que garantice una mejor eciencia para su control. La baja eciencia del fungicida sintético para el control de F. oxysporum en las semillas de garbanzo probablemente se deba a la resistencia hacia los grupos químicos del fungicida, la virulencia del topatógeno, susceptibilidad del hospedero, condiciones abióticas, entre otros (Mengist et al., 2018). Conclusiones El extracto etanolicó de L. palmeri disminuyó in vitro el crecimiento radial de F. solani y F. oxysporum y 384 Esta publicación cientíca en formato digital es continuación de la Revista Impresa: Depósito legal pp 196802ZU42, ISSN 0378-7818. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2020, 37: 368-386. Octubre-Diciembre. Romero-Bastidas et al. ISSN 2477-9407 su aplicación en semillas de garbanzo redujo la incidencia de ambos topatógenos. Los extractos de plantas pueden ser una opción eciente en el manejo de hongos topatógenos asociados a semillas, siendo una solución ecológica y de bajo costo. Literatura citada Andrade-Bustamante, G., L. Cervantes- Díaz, C. Ail-Catzim, C. del Toro- Sánchez, J. Borboa-Flores, P. Preciado-Rangel, F. Martínez-Ruiz y E. Rueda-Puente. 2018. Potential of oregano and cachanilla extracts for the control of phytopathogenic fungi in tomato fruits. ITEA 114(4): 344- 352. Borboa-Flores, J., E. Rueda-Puente, E. Acedo-Félix, J. Ponce, M. Cruz- Villegas, J. García-Hernández y M. Ortega-Nieblas. 2010. Evaluación de la actividad antibacteriana in vitro de aceites esenciales contra Clavibacter michiganensis subespecie michiganensis . Trop. Subtrop. Agroecosyst. 12(3): 539-547. Daryaei, A., E. Jones, T. Glare y R. Falloon. 2016. Nutrient amendments affect Trichoderma atroviride conidium production, germination and bioactivity. Biol. Control 93: 8-14. El Hazzat, N., A. Touhami, M. Chliyeh, A. Erri, K. 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